纳米氧化锌对NLRP3炎性小体的激活作用及机制

发布时间：2017-08-19 02:07

  本文关键词：纳米氧化锌对NLRP3炎性小体的激活作用及机制

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【摘要】：背景纳米氧化锌(Zinc Oxide Nano-Particles,ZnO-NPs)是一种新型高功能无机精细产品,具有宏观材料所不具备的表面效应、量子尺寸效应以及宏观隧道效应、高分散性等特点,被广泛应用于陶瓷、化工、电子、光学、生物、医药、国防等许多领域。与此同时,纳米氧化锌的毒性作用也受到了人们的广泛关注。纳米氧化锌主要通过呼吸道进入机体,由于其具有较小粒径,可进入到肺泡深部,诱导呼吸道上皮细胞活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)生成量增多,诱发炎性反应。NLRP3(Nod-liker Recptor Protein 3,NLRP3)炎性小体是炎性反应的重要组成部分,是由NLRP3分子、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ACS)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine-requiring aspartate protease-1,caspase-1)组成的分子量约为700 k D的蛋白复合体,可以被ROS活化。活化的NLRP3炎性小体可以切割炎性因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-18前体,促进其成熟释放,从而诱导其他炎性因子的分泌,促进炎性反应的发展进程。研究表明核转录因子(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)可以调控NLRP3炎性小体的活化,促进炎性因子的分泌。然而,纳米氧化锌引发炎性反应中NLRP3炎性小体是否被活化并发挥作用未见报道。本课题选用人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)作为研究对象,以纳米氧化锌颗粒物(ZnO-NPs)作为刺激物,研究NLRP3炎性小体的活化在ZnO-NPs诱发A549细胞产生炎性反应中的作用及机制。方法1、ZnO-NPs对A549细胞的脂质过氧化作用:不同浓度(0、10、20、40μg/m L)ZnO-NPs刺激A549细胞4、8、24 h,染毒结束后收集各组细胞。应用流式细胞仪检测各组细胞内ROS平均荧光信号强度(Mean Fluorescence Intensity,MFI)来反映各组细胞内ROS水平;应用丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性检测试剂盒分别检测各组细胞内MDA含量和SOD活性。2、ZnO-NPs对A549细胞内NF-κB的活化作用:不同浓度ZnO-NPs刺激A549细胞24 h,染毒结束后收集各组细胞。应用蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测细胞内磷酸化p65的表达水平以反映细胞内NF-κB的活化水平。3、ZnO-NPs对A549细胞内NLRP3炎性小体的激活作用:不同浓度ZnO-NPs刺激A549细胞12 h,染毒结束后收集各组细胞,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time fluorescent quantitative Polymerase Chain Reaction,Real-time PCR)检测NLRP3 m RNA的表达水平;ZnO-NPs刺激A549细胞24 h,染毒结束后收集各组细胞及培养上清,应用Western Blot检测细胞内NLRP3、Caspase-1活性小亚基p10的蛋白表达水平;应用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay,ELISA)检测A549细胞培养上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表达水平。4、抑制剂对通路的影响:4.1活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)对NF-κB、NLRP3炎性小体活化的影响:NAC预处理A549细胞后用ZnO-NPs刺激A549细胞24 h,染毒结束后收集各组细胞及培养上清。应用Western Blot分别检测各组细胞内磷酸化p65、NLRP3、caspase-1活性小亚基p10的蛋白表达量;应用ELISA检测A549细胞培养上清中炎性因子IL-1β、IL-18的含量。4.2 NF-κB抑制剂BAY11-7082(BAY)对ROS、NLRP3炎性小体表达水平的影响:BAY11-7082预处理A549细胞后用ZnO-NPs刺激A549细胞8 h,染毒结束后收集各组细胞,应用流式细胞仪检测细胞ROS的表达水平;BAY11-7082预处理A549后用ZnO-NPs刺激A549细胞24 h,染毒结束后收集各组细胞及培养上清,应用Western Blot检测各组细胞内NLRP3、caspase-1活性小亚基p10的表达量;应用ELISA检测A549细胞培养上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表达水平。4.3 NLRP3抑制剂格列本脲(Glibenclamide,GEL)对炎性因子IL-1β、IL-18的影响:GEL预处理A549细胞后用ZnO-NPs刺激A549细胞24 h,染毒结束后收集各组细胞培养上清,应用ELISA分别检测细胞培养上清中炎性因子IL-1β、IL-18的含量。结果1、ZnO-NPs对A549细胞的脂质过氧化作用:相同染毒剂量下,各组细胞ROS水平和MDA的含量随着染毒时间的增加而升高,差异均具有统计学意义(P0.05);相同染毒时间下,随着染毒剂量的增加,ROS水平与MDA含量也随之增加,差异均具有统计学意义(P0.05)。SOD的活性随着染毒时间与剂量的增加呈下降趋势,差异均具有统计学意义(P0.05)。2、ZnO-NPs对A549细胞NF-κB活化水平的影响:WB结果显示,0、10、20、40μg/m L剂量组磷酸化p65的相对表达水平分别为0.23、0.45、0.96、1.12;随着染毒剂量的增加,NF-κB的活化水平呈现上升趋势。3、ZnO-NPs对A549细胞NLRP3炎性小体活化的影响:3.1 ZnO-NPs对A549细胞NLRP3与caspase-1表达的影响:Real Time-PCR结果显示NLRP3 m RNA的表达水平随着染毒剂量增加而升高,各剂量组与对照组相比较,差异均具有统计学意义(P0.05)。Western Blot结果表明,随着染毒剂量的增加,NLRP3炎性小体与Caspase-1活性小亚基p10的蛋白表达水平也随之升高。3.2 ZnO-NPs对A549细胞炎性因子IL-1β、IL-18表达水平的影响:ELISA结果显示,各组细胞炎性因子IL-1β和IL-18的含量随着染毒剂量的增加升高。与对照组相比较,20、40μg/m L剂量组IL-1β、IL-18的表达水平均升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与10μg/m L组相比较,40μg/m L剂量组IL-1β、IL-18的表达水平均升高,差异具有统计学意义(P0.05)。4应用抑制剂对信号通路的影响:4.1 ROS抑制剂NAC对NF-κB、NLRP3炎性小体表达水平的影响:与对照组比较,ZnO-NPs刺激可明显提高细胞内磷酸化p65、NLRP3与Caspase-1活性小基p10的蛋白表达水平,可使细胞培养上清中的IL-1β、IL-18的含量升高。NAC预处理可显著降低ZnO-NPs诱导的细胞内磷酸化p65、NLRP3、p10的蛋白高表达和IL-1β、IL-18的高表达。4.2 NF-κB抑制剂BAY11-7082对ROS、NLRP3炎性小体表达水平的影响:ZnO-NPs刺激8h后ROS表达水平(用MFI表示)为9543.44±272.81,应用NF-κB抑制剂BAY11-7082后ROS表达水平为9042.65±314.19,两组相比ROS水平差异无统计学意义(P0.05)。WB结果显示,BAY11-7082预处理可显著降低ZnO-NPs诱导的NLRP3与p10的高表达。ELISA结果显示,ZnO-NPs刺激后细胞培养上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表达水平分别为(1.60±0.09)μg/m L、(739.02±29.40)pg/m L,BAY11-7082预处理后IL-1β、IL-18的表达水平分别为(1.08±0.12)μg/m L、(331.27±70.65)pg/m L,差异均具有统计学意义(P0.05)。4.3 NLRP3抑制剂格列本脲对炎性因子IL-1β、IL-18的影响:ZnO-NPs刺激后细胞培养上清中炎性因子IL-1β、IL-18表达水平分别为(1.60±0.09)μg/m L、(739.02±29.40)pg/m L;应用NLRP3抑制剂格列本脲预处理后,IL-1β、IL-18表达水平分别为(0.96±0.10)μg/m L、(173.02±20.44)pg/m L;格列本脲预处理可显著降低ZnO-NPs诱导的IL-1β、IL-18高表达,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论纳米氧化锌颗粒物可诱导A549细胞中NLRP3炎性小体的活化,可能是通过ROS-NF-κB-NLRP3信号通路发挥作用的。
【关键词】：纳米氧化锌 NLRP3炎性小体 活性氧 核转录因子-κB
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TB383.1;R364.5
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 英文缩略词汇表15-19
• 引言19-22
• 材料与方法22-37
• 2.1 材料22-25
• 2.1.1 实验对象与染毒物22
• 2.1.2 主要试剂22-23
• 2.1.3 主要仪器23-24
• 2.1.4 主要试剂的配制24-25
• 2.2 方法25-37
• 2.2.1 细胞培养方法25-27
• 2.2.2 细胞染毒及分组方法27
• 2.2.3 ZnO-NPs对A549细胞的脂质过氧化作用27-29
• 2.2.4 ZnO-NPs对A549细胞NF-κB表达水平的影响29-32
• 2.2.5 ZnO-NPs对A549细胞NLRP3炎性小体表达水平的影响32-36
• 2.2.6 应用抑制剂对通路的影响36
• 2.2.7 数据分析处理36-37
• 结果37-51
• 3.1 ZnO-NPs对A549细胞脂质过氧化作用的影响37-40
• 3.1.1 ZnO-NPs对A549细胞活性氧水平的影响37-38
• 3.1.2 ZnO-NPs对A549细胞丙二醛含量的影响38-39
• 3.1.3 ZnO-NPs对A549细胞超氧化物歧化酶活性的影响39-40
• 3.2 ZnO-NPs对A549细胞核转录因子NF-κB的表达水平的影响40-41
• 3.3 ZnO-NPs对A549细胞NLRP3炎性小体活化水平的影响41-45
• 3.3.1 ZnO-NPs对A549细胞NLRP3 m RNA表达水平的影响41-43
• 3.3.2 ZnO-NPs对A549细胞NLRP3蛋白表达水平的影响43
• 3.3.3 ZnO-NPs对A549细胞炎性因子IL-1β、IL-18 表达水平的影响43-45
• 3.4 应用抑制剂对通路的影响45-51
• 3.4.1 活性氧抑制剂NAC对NF-κB、NLRP3炎性小体表达水平的影响45-47
• 3.4.2 NF-κB抑制剂BAY11-7082 对ROS、NLRP3炎性小体的影响47-49
• 3.4.3 NLRP3抑制剂格列本脲对炎性因子IL-1β、IL-18 的影响49-51
• 讨论51-55
• 4.1 ZnO-NPs对A549细胞的脂质过氧化损伤作用51-52
• 4.2 Nano-ZnO对A549细胞NF-κB活化水平的影响52-53
• 4.3 Nano-ZnO对A549细胞NLRP3炎性小体活化水平的影响53-55
• 结论55-56
• 参考文献56-59
• 综述59-68
• 1. NLRP3炎性小体的结构60
• 2. NLRP3炎性小体的活化60-62
• 3. NLRP3炎性小体与疾病的关系62-64
• 4. 结论64-65
• 5. 参考文献65-68
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果68-69
• 致谢69

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