单激发-双通道成像策略用于细胞表面特定糖蛋白上糖型的分析

发布时间：2017-09-20 14:23

  本文关键词：单激发-双通道成像策略用于细胞表面特定糖蛋白上糖型的分析

  更多相关文章： 碳水化合物 双通道LRET 纳米粒子 近红外激发 特定糖蛋白上糖成像

【摘要】：聚糖作为细胞基本组分之一,参与细胞粘附、细胞间通讯、信号转导、受体激活以及细胞内吞等一系列重要的生物学过程。同时,特定蛋白上的糖型表达与细胞特定生理功能间有密切联系,糖基化的动态变化也反映了疾病的进程和状态。因此,细胞表面特定蛋白上的糖基化与糖型的检测是当前生命分析化学领域的研究热点。上转换纳米粒子(UNP)因为具有近红外光激发、上转换多色发光、发射峰窄、斯托克斯位移大、光渗透深度大、生物相容性好以及发射光波长可调谐等一系列优点,而成为近年来研究的热点,被用作生物探针或药物载体。基于UNP的上转换发光共振能量转移体系因为没有能量受体的Bleed-through现象而被用于生物检测中,可显著地提高检测的灵敏度和准确性。本文利用上转换纳米材料(UNP)的近红外单色激发、多色发射的特点,结合糖代谢标记技术,通过在细胞表面的特定蛋白位点上建立单激发-双通道的发光共振能量转移体系(D-LRET),实现了特定糖蛋白上两种单糖的同时成像。具体工作如下所示：本文通过在细胞表面的特定蛋白位点上建立单激发-双通道的上转换发光共振能量转移(D-LRET)体系,实现了特定糖蛋白上两种单糖的同时成像。这个单激发双通道成像体系利用核酸适配体功能化的上转换纳米粒子作为能量供体连接到细胞表面的特定糖蛋白上,两种不同的荧光分子作为能量受体通过双糖代谢标记技术标记到细胞表面的两种单糖上。在980 nm近红外光激发下,通过-对平行发生的共振能量转移,使连接到特定糖蛋白的两种单糖上的荧光分子被点亮,从而实现特定糖蛋白上两种单糖的同时成像。以黏蛋白MUC1作为蛋白模型,利用该策略可对三种细胞的MUC1上的糖型进行原位可视化表征,并且可定量分析MUC1上两种单糖的相对表达情况及追踪外界药物对相对表达的影响。该方法为特定糖蛋白上糖型的检测提供了一个普适的平台,从而有助于研究糖基化对蛋白质功能的调节机理。
【关键词】：碳水化合物 双通道LRET 纳米粒子 近红外激发 特定糖蛋白上糖成像
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q26;TB383.1
【目录】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 本论文的主要创新点12-13
• 第一章 绪言13-34
• 1.1 细胞表面的聚糖14-15
• 1.1.1 糖复合物14
• 1.1.2 聚糖的结构14-15
• 1.1.3 聚糖的功能15
• 1.2 细胞表面聚糖的识别与检测15-20
• 1.2.1 凝集素识别16-17
• 1.2.2 基于分子改造的化学共价识别17-18
• 1.2.3 糖代谢标记技术18-19
• 1.2.4 直接化学共价识别19-20
• 1.3 特定糖蛋白上单糖的成像分析20-24
• 1.3.1 细胞表面特定糖蛋白上糖成像21-23
• 1.3.2 细胞内特定糖蛋白上糖成像23-24
• 1.4 上转换纳米粒子及其在生物检测中的应用24-25
• 1.5 黏蛋白MUC1及其家族25-29
• 1.5.1 黏蛋白的功能25-26
• 1.5.2 黏蛋白家族的序列和结构26-27
• 1.5.3 黏蛋白MUC127-29
• 1.6 选题意义及研究内容29-30
• 参考文献30-34
• 第二章 单激发-双通道成像策略用于细胞表面特定糖蛋白上糖型的分析34-65
• 2.1 引言34-36
• 2.2 实验部分36-43
• 2.2.1 材料和试剂36-37
• 2.2.2 仪器设备37
• 2.2.3 细胞培养37-38
• 2.2.4 核壳结构的上转换纳米粒子NaYF_4：Er/Gd/Yb@NaGdF_4的合成38
• 2.2.5 合成Oleate-free UNP38-39
• 2.2.6 合成A30-COOH修饰的UNP(A30-UNP)39
• 2.2.7 合成和核酸适配体功能化的UNP(Apt-UNP)39
• 2.2.8 细胞免疫分析实验39-40
• 2.2.9 流式细胞分析验证核酸适配体特异性40
• 2.2.10 共聚焦显微成像分析验证核酸适配体特异性40
• 2.2.11 UNP表面Apt的装载量40-41
• 2.2.12 扫描电镜及透射电镜表征Apt-UNP在细胞表面特定位点上的识别41
• 2.2.13 体外双通道能量共振转移(D-LRET)实验41
• 2.2.14 MUC1上盐藻糖的成像及正交标记41-42
• 2.2.15 双通道成像及数据分析42-43
• 2.2.16 衣霉素处理阻碍N-型糖的糖基化43
• 2.3 结果与讨论43-62
• 2.3.1 方案设计43-44
• 2.3.2 UNP的功能化及表征44-45
• 2.3.2.1 TEM表征44-45
• 2.3.2.2 其它表征方法45
• 2.3.3 免疫荧光法证明细胞表面MUC1的表达45-46
• 2.3.4 核酸适配体S2.2的特异性验证46-47
• 2.3.4.1 流式细胞法46-47
• 2.3.4.2 激光共聚焦显微成像法47
• 2.3.5 Apt-UNP与MUC1~+细胞的特异性结合47-48
• 2.3.6 电镜实验表征Apt-UNP在细胞表面的分布48-49
• 2.3.6.1 SEM实验48-49
• 2.3.6.2 基于TEM的共定位实验49
• 2.3.7 D-LRET体系中能量受体的选择49-50
• 2.3.8 体外实验验证D-LRET50-51
• 2.3.9 体外实验排除两组LRET间的相互干扰51-52
• 2.3.9.1 荧光激发实验51-52
• 2.3.9.2 LRET1与LRET2信号间的相互影响52
• 2.3.10 体外实验验证LRET信号强度与能量受体浓度的关系52-53
• 2.3.11 基于单LRET的MUC1上岩藻糖的成像53-54
• 2.3.12 代谢时间的优化54-55
• 2.3.13 基于D-LRET的MUC1上的双糖成像55-56
• 2.3.14 细胞表面D-LRET的验证56-57
• 2.3.15 终端糖岩藻糖和唾液酸的相对表达量分析57-60
• 2.3.15.1 糖内标成像57-59
• 2.3.15.2 D-LRET成像成像数据分析59-60
• 2.3.16 蛋白分子内D-LRET的验证60-61
• 2.3.17 D-LRET效率61
• 2.3.18 药物处理下岩藻糖/唾液酸的动态变化61-62
• 2.4 结论62-63
• 参考文献63-65
• 附录65-66
• 致谢66-68

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