卵泡抑素在纳米二氧化硅诱导的氧化应激中的保护作用及机制研究

发布时间：2017-10-08 15:44

  本文关键词：卵泡抑素在纳米二氧化硅诱导的氧化应激中的保护作用及机制研究

  更多相关文章： SiO_2NP FST 转录 凋亡 ROS

【摘要】：伴随纳米二氧化硅(SiO2 NP)颗粒在工业、生物医药等领域的广泛应用,其对人类健康的潜在危害越来越受人们关注。呼吸道是SiO2 NP主要暴露部位,因此SiO2 NP对呼吸系统的毒性作用得到广泛研究。研究表明,SiO2 NP可引起呼吸道上皮细胞及巨噬细胞的氧化应激。为应对氧化应激损伤,细胞主要通过活化转录因子Nrf2从而促进一些抗氧化基因、抗凋亡基因等的表达。然而,目前对SiO2 NP应激蛋白及它们作用的认识尚不全面。卵泡抑素(Follistatin, FST)为一分泌性蛋白,在细胞外结合TGF-p超家族成员而使其失活,从而参与了细胞生长、发育、分化和分泌等多种生物学过程的调节。本课题组近来发现多种细胞应激如糖剥夺、缺氧时可诱导细胞内FST表达,高表达的FST可发挥对细胞的保护作用。然而FST是否响应SiO2 NP刺激尚不清楚。为明确FST在SiO2 NP引起的细胞氧化损伤中的作用,我们首先研究了Si02NP暴露对FST表达的影响。体内实验结果显示,SiO2 NP暴露1天、2天小鼠肺组织的FST mRNA水平显著增加。蛋白质免疫印迹和免疫组化结果也显示,SiO2 NP暴露后1天、7天小鼠的肺组织FST蛋白水平均显著增加。体外结果显示,SiO2NP处理后,肺泡上皮细胞(A549)细胞中FSTmRNA和蛋白水平均显著增加。以上结果表明,FST为一SiO2 NP响应蛋白。FST mRNA水平的增加可能是其基因转录增加,也可能是其mRNA的降解减少。首先,我们利用放线菌素D抑制新mRNA的合成,随后检测剩余FST mRNA的半衰期。发现与对照组相比,SiO2 NP处理组FST mRNA降解速率并无改变,提示SiO2 NP并不影响FST的稳定性。荧光素酶报告实验结果显示,SiO2 NP处理后FST启动子活性显著升高；染色质免疫沉淀(ChIP)实验结果表明,FST基因启动子区的活性染色质标志物Ac-H3(K9/18)以及H3K4me2水平显著增加,表明SiO2 NP可促进FST基因转录。Nrf2是响应氧化应激的主要转录因子。为明确Nrf2在SiO2 NP促进FST基因转录的作用,我们利用siRNA抑制细胞内Nrf2的表达,发现FST表达水平也显著降低。生物信息学分析发现,FST启动子区含有Nrf2的结合序列(ARE)。荧光素酶报告实验结果显示,将Nrf2结合序列去除后,FST的转录不再受Nrf2表达水平的影响,表明Nrf2可通过ARE序列促进FST的表达。最后,ChIP实验结果显示,Nrf2可与FST启动子区结合,SiO2 NP处理显著增加了Nrf2与FST启动子的结合,表明Nrf2直接结合在FST启动子区。以上结果表明,Nrf2直接结合在FST启动子区的ARE序列上,从而促进FST转录。为研究FST在SiO2N P诱导的细胞损伤中的作用,我们抑制细胞内FST表达,随后检测细胞凋亡。对体外培养的A549细胞进行Annexin V染色发现,SiO2 NP处理可诱导细胞凋亡,利用siRNA抑制FST表达后细胞凋亡率显著增加,表明FST可减少SiO2NP诱导的细胞凋亡。对小鼠肺组织进行TUNNEL标记发现,SiO2 NP暴露可引起终末细支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞凋亡增加,利用shRNA抑制FST表达后细胞凋亡率进一步增加。综上所述,FST在体内、体外均可减少SiO2 NP诱导的细胞凋亡。最后,我们研究了FST对细胞ROS产生的影响。发现SiO2(?) (?)P处理后,细胞内总ROS水平显著升高,抑制FST表达后ROS水平明显高于对照组,而过表达FST组ROS水平显著低于对照组。表明FST抑制细胞内ROS产生。进一步,我们研究了FST对GAPDH氧化酶(NOX)家族成员表达的影响。结果显示,抑制FST表达后细胞NOX1和NX5的mRNA水平显著性上调,而过表达FST后细胞NOXl和NOX5的mriRNA水平显著性下调。以上结果提示,FST通过抑制NOXl和NOX5的表达从而抑制SiO2NP诱导的ROS产生。综上所述,本学位论文的主要发现包括：1)SiO2NP诱导小鼠肺组织和培养的肺上皮细胞中FST的表达；2)SiO2NP通过调控Nrf2进而活化FST基因；3)FST抑制SiO2NP诱导的细胞凋亡；4)FST抑制NOX1、NOX5基因表达及细胞内ROS产生。以上结果证明FST为一SiO2 NP应激蛋白,在SiO2 NP引起的氧化应激中发挥重要的保护作用。这将有助于阐明SiO2 NP发挥毒性效应的分子机制,并可能为针对SiO2 NP的防护提供可能靶点。
【关键词】：SiO_2NP FST 转录 凋亡 ROS
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114;TB383.1
【目录】：

• 致谢5-8
• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 缩略语表15-18
• 1. 引言18-24
• 1.1. 纳米二氧化硅的毒理学研究18-21
• 1.2. 卵泡抑素及其生物学功能21-24
• 2. 材料和试剂24-31
• 2.1. 主要试剂24-26
• 2.2. 抗体26
• 2.3. 主要仪器设备及耗材26-28
• 2.4. 引物设计28-31
• 3. 实验方法与原理31-47
• 4. 实验结果47-61
• 4.1. SiO_2NP的表征47-49
• 4.2. SiO_2 NP促进小鼠肺组织和人肺泡上皮细胞FST的表达49-52
• 4.3. SiO_2 NP促进FST表达的分子机制52-56
• 4.4. FST抑制SiO_2NP诱导的细胞凋亡56-58
• 4.5. FST抑制SiO_2 NP诱导的氧化应激58-61
• 5. 讨论61-66
• 6. 结论66-67
• 7. 参考文献67-70
• 本学位论文创新点70-71
• 综述71-80
• 参考文献77-80
• 作者简历及科研成果80-81

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