基于船用涂料中修饰褐藻胶增稠剂的生物酶挖掘改造研究
发布时间：2022-08-07 23:39
对海洋资源进行合理的开发和运用是人类生态文明建设和发展的重要组成部分,但海洋腐蚀也是必须面对和解决的一个重要问题。涂层防护法作为船舶防腐的有效办法已得到了广泛的认可和使用,而选择性能良好的涂料是实施该方法的关键。增稠剂作为一类重要的涂料添加剂,可使涂料获取出色的机械性能和良好的物理化学稳定性。褐藻胶因具有良好的凝胶性能和环保特点,在船舶涂料增稠剂方向存在广阔的发展空间。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古罗糖醛酸（G）组成的线型聚合物。由于两种残基在分子链中的分布不同,导致褐藻酸酸盐链中存在三种不同类型的片段结构:MM片段、MG片段和GG片段。不同的M/G比例和分布对凝胶的形成有直接的影响,其中GG-片段含量较高的褐藻胶形成的凝胶强度较好,但天然褐藻胶往往GG-片段含量较低,因此本文从生物学角度出发,试图利用甘露糖醛酸C-5差向异构酶将M转变为G,以此提高GG-片段的含量来使褐藻胶满足涂料增稠剂的需求。本论文以褐藻酸钠为唯一碳源,从海胆的肠胃中筛选到一株褐藻胶修饰酶活性较高的菌株。通过16S rDNA系统发育学对野生菌株进行分析,发现菌株C-H属于假单胞菌属。进一步通过生物信...
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 船舶防腐的必要性
1.1.1 防腐措施以及涂层防护的优势
1.1.2 涂料助剂中的增稠剂以及褐藻胶的优势
1.2 褐藻胶的概述
1.2.1 褐藻胶在我国的生产和研究
1.2.2 褐藻胶的生物合成
1.2.3 褐藻胶的结构及其性质
1.2.4 GG-片段的分布和含量对增稠剂的影响
1.3 生物酶法修饰褐藻胶
1.3.1 藻类中的甘露糖醛酸C-5差向异构酶
1.3.2 细菌中的甘露糖醛酸C-5差向异构酶
1.4 立题依据和研究内容
1.4.1 立题背景及意义
1.4.2 技术路线和主要内容
2 菌株的筛选与鉴定
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 样品来源
2.2.2 培养基
2.2.3 相关试剂
2.2.4 实验器材
2.3 实验方法
2.3.1 菌株的分离
2.3.2 DNS法测定褐藻胶裂解酶酶活
2.3.3 菌株的鉴定
2.4 结果分析
2.4.1 样本的采集及产酶菌株的筛选
2.4.2 16S rDNA序列分析与系统发育树的建立
2.5 本章小结
3 甘露糖醛酸C-5差向异构酶PmC5A的基因克隆和表达
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株
3.2.2 引物
3.2.3 质粒
3.2.4 培养基
3.3 相关试剂
3.4 实验器材
3.5 实验方法
3.5.1 甘露糖醛酸C-5差向异构酶基因的克隆及表达载体的构建
3.5.2 重组双功能酶的诱导表达
3.5.3 SDS-PAGE
3.5.4 BCA法测定蛋白浓度
3.6 结果分析
3.6.1 甘露糖醛酸C-5差向异构酶PmC5A的克隆
3.6.2 甘露糖醛酸C-5差向异构酶PmC5A的生物信息学分析
3.6.3 PmC5A在大肠杆菌内的重组表达及Ni-NTA亲和纯化
3.7 本章小结
4 褐藻胶修饰酶PmC5A的功能测定及酶学性质探究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株与培养基
4.2.2 酶学性质分析的相关试剂
4.3 实验方法
4.3.1 ~1H NMR测定甘露糖醛酸C-5差向异构酶活性
4.3.2 pH对PmC5A的两种功能酶活性的影响
4.3.3 温度对PmC5A的两种功能酶活性的影响
4.3.4 金属离子对PmC5A的褐藻胶裂解酶的酶活性影响
4.3.5 PmC5A的褐藻胶裂解酶的底物特异性
4.4 结果分析
4.4.1 ~1H NMR图谱解析
4.4.2 ~1H NMR测定PmC5A的酶功能
4.4.3 PmC5A的两种功能酶的酶学性质
4.5 本章小结
5 褐藻胶修饰酶PmC5A的改造
5.1 引言
5.2 实验材料
5.2.1 菌株及质粒
5.2.2 引物
5.2.3 培养基
5.3 相关试剂
5.3.1 分子克隆的主要试剂
5.3.2 蛋白纯化的主要试剂
5.3.3 酶活测定的主要试剂
5.4 实验方法
5.4.1 突变酶基因的RF克隆
5.4.2 RF克隆产物的转化
5.4.3 菌落PCR及测序鉴定
5.4.4 突变酶的诱导表达
5.4.5 SDS-PAGE
5.4.6 突变酶活性测定
5.5 结果分析
5.5.1 突变位点及loop~(271-387)的选择
5.5.2 突变酶的诱导表达及纯化
5.5.3 突变酶的活性测定及分析
5.6 本章小结
6 总结与展望
6.1 结论与创新点
6.2 后续工作展望
参考文献
致谢
作者简历及攻读硕士学位期间的科研成果
本文编号：3671252
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 船舶防腐的必要性
1.1.1 防腐措施以及涂层防护的优势
1.1.2 涂料助剂中的增稠剂以及褐藻胶的优势
1.2 褐藻胶的概述
1.2.1 褐藻胶在我国的生产和研究
1.2.2 褐藻胶的生物合成
1.2.3 褐藻胶的结构及其性质
1.2.4 GG-片段的分布和含量对增稠剂的影响
1.3 生物酶法修饰褐藻胶
1.3.1 藻类中的甘露糖醛酸C-5差向异构酶
1.3.2 细菌中的甘露糖醛酸C-5差向异构酶
1.4 立题依据和研究内容
1.4.1 立题背景及意义
1.4.2 技术路线和主要内容
2 菌株的筛选与鉴定
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 样品来源
2.2.2 培养基
2.2.3 相关试剂
2.2.4 实验器材
2.3 实验方法
2.3.1 菌株的分离
2.3.2 DNS法测定褐藻胶裂解酶酶活
2.3.3 菌株的鉴定
2.4 结果分析
2.4.1 样本的采集及产酶菌株的筛选
2.4.2 16S rDNA序列分析与系统发育树的建立
2.5 本章小结
3 甘露糖醛酸C-5差向异构酶PmC5A的基因克隆和表达
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株
3.2.2 引物
3.2.3 质粒
3.2.4 培养基
3.3 相关试剂
3.4 实验器材
3.5 实验方法
3.5.1 甘露糖醛酸C-5差向异构酶基因的克隆及表达载体的构建
3.5.2 重组双功能酶的诱导表达
3.5.3 SDS-PAGE
3.5.4 BCA法测定蛋白浓度
3.6 结果分析
3.6.1 甘露糖醛酸C-5差向异构酶PmC5A的克隆
3.6.2 甘露糖醛酸C-5差向异构酶PmC5A的生物信息学分析
3.6.3 PmC5A在大肠杆菌内的重组表达及Ni-NTA亲和纯化
3.7 本章小结
4 褐藻胶修饰酶PmC5A的功能测定及酶学性质探究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株与培养基
4.2.2 酶学性质分析的相关试剂
4.3 实验方法
4.3.1 ~1H NMR测定甘露糖醛酸C-5差向异构酶活性
4.3.2 pH对PmC5A的两种功能酶活性的影响
4.3.3 温度对PmC5A的两种功能酶活性的影响
4.3.4 金属离子对PmC5A的褐藻胶裂解酶的酶活性影响
4.3.5 PmC5A的褐藻胶裂解酶的底物特异性
4.4 结果分析
4.4.1 ~1H NMR图谱解析
4.4.2 ~1H NMR测定PmC5A的酶功能
4.4.3 PmC5A的两种功能酶的酶学性质
4.5 本章小结
5 褐藻胶修饰酶PmC5A的改造
5.1 引言
5.2 实验材料
5.2.1 菌株及质粒
5.2.2 引物
5.2.3 培养基
5.3 相关试剂
5.3.1 分子克隆的主要试剂
5.3.2 蛋白纯化的主要试剂
5.3.3 酶活测定的主要试剂
5.4 实验方法
5.4.1 突变酶基因的RF克隆
5.4.2 RF克隆产物的转化
5.4.3 菌落PCR及测序鉴定
5.4.4 突变酶的诱导表达
5.4.5 SDS-PAGE
5.4.6 突变酶活性测定
5.5 结果分析
5.5.1 突变位点及loop~(271-387)的选择
5.5.2 突变酶的诱导表达及纯化
5.5.3 突变酶的活性测定及分析
5.6 本章小结
6 总结与展望
6.1 结论与创新点
6.2 后续工作展望
参考文献
致谢
作者简历及攻读硕士学位期间的科研成果
本文编号：3671252
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/chuanbolw/3671252.html
