基于微流控技术构建多细胞肿瘤球实验模型

发布时间：2020-03-27 21:42

【摘要】：体内几乎所有的细胞,都暴露于由各种细胞和复杂细胞外基质所组成的三维(three-dimensional,3-D)环境中。在一定程度上,细胞的特异性3-D排布,决定了所构成组织和器官的功能。在传统的二维(two-dimensional,2-D)细胞培养体系中,细胞仅仅只能附着在平坦硬质的培养皿表面,缺乏细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用,不能用来模拟复杂的3-D肿瘤结构的形成,也不能用来研究细胞与细胞外微环境间相互作用。因此,构建体外3-D实验模型,更真实的反映体内的组织环境,对于抗癌研究有非常重要的意义。3-D细胞培养模型,可以更真实地反映体内实体肿瘤的三维空间结构。近些年来,各种各样的三维细胞培养系统被研究者们所使用,但最受欢迎、最有效的模型就是多细胞肿瘤球。通过不同的技术手段可以获得多细胞肿瘤球,相比于传统的2-D细胞培养系统以及其它的多细胞肿瘤球获取方法,利用微流控芯片技术获取多细胞肿瘤球具有更显著的优势。在本论文中,描述了一个稳定可靠的微流控实验装置,基于微流控和微加工技术,成功的获取了具有精确控制尺寸,大小均一以及可实时调整水凝胶基质组分的壳核式水凝胶细胞微球,为操控细胞及其微环境提供了更有效的平台。为了更好地理解凝胶微球形成的机制,基于多相流数值模型,本研究利用COMSOL Multiphysics软件对微液滴的生成过程以及流场的演化过程进行了数值模拟。仿真模拟结果观察到了尺寸对流速的依赖性以及涡流对壳核式微球结构形成的影响,与实验结果有很好的一致性。主要工作包括以下三个方面:(1)微流控芯片的设计和制作:利用L-edit软件设计芯片的几何结构,采用软光刻技术以及表面等离子体键合技术等,制作了符合实验要求的PDMS微流控芯片。此外,基于多相流数值模型,对所设计的微流控芯片中液滴生成的动力学过程进行数值仿真模拟,仿真结果证明了芯片设计结构的可行性,为后续芯片实验操作提供了重要的参考依据。(2)水凝胶微球获取:使用微流控芯片成功的获取了大小尺寸均一的凝胶微液滴,实验结果也验证了仿真模拟结果的正确性。利用实验方法和数值模拟方法,针对油相流速对液滴大小的影响进行了研究,实验结果和数值仿真结果有很好的一致性。此外,在两水相流速比变化的情况下,探究了芯片通道内荧光强度的分布,证明了微流控芯片可以实时调整凝胶微球的基质组分。(3)包裹细胞的壳核式凝胶微球获取:搭建了受控的低温冷却装置,结合微流控芯片技术,成功的将肿瘤细胞包裹到壳核式的凝胶结构中。实验发现油相O2的流速对壳核式结构的形成具有显著的影响。利用COMSOL Multiphysics软件,对液滴生成过程中变形液滴内流场的演变过程进行了数值模拟,发现由于增大的油相速度使得水相受到了更大的压力和剪切力的作用,导致流场产生了不稳定的涡流。不稳定涡流的出现破坏了异质的壳核分层结构,数值仿真结果和实验结果有很好的一致性。异质的壳核式微球结构,为更好的模拟体内细胞外微环境,以及观察细胞和细胞外基质间相互作用提供了可能性。此外,通过标准的吖啶橙和碘化丙锭(AO/PI)双染色法,对四种不同的水凝胶组分中癌细胞的增殖和活性进行了评估。
【图文】：

多细胞,实验模型,肿瘤

研究提供了生物基础[25]。Carey 等（2013）利用多细胞球共培养模型力强的恶性细胞会诱导原本正常上皮细胞发生侵袭，，并且这两种细过程中始终表现出不同的领导者和追随者角色；实验结果表明肿瘤种亚群之间存在复杂的相互作用，并影响临床结果[26]。Labernadie 等（结果表明，成纤维细胞会对癌细胞施加了一种物理作用力，即机械粘附，并引导癌细胞迁移以及促使肿瘤侵袭[27]。细胞肿瘤球（如图 1.1），作为经典的癌细胞 3-D 培养模型，可以更内实体肿瘤的 3-D 空间组织结构[11, 28]。通常实验获取的多细胞肿瘤毫米大小，大多存在分层的异质性结构。最中心的“核”部分是由营养物质而形成的坏死的部分；中间层为休眠的细胞；而最外层细细胞，在侵袭时分化出高侵袭性的癌细胞。多细胞肿瘤球所形成的，为研究细胞亚群间、细胞与环境之间相互作用创造了实验平台，现了体内肿瘤组织的异质性。肿瘤组织的 3-D 异质性结构，是无法培养系统所能得到的。

示意图,微通道,微流控芯片,共轴

流控芯片三种典型的微通道示意图（a）流动聚焦型微通道；（（c）共轴流型微通道。Illustrations of the three main microfluidic geometries used for droplFlow focusing, (b) T-junction and (c) Co-flowing.控芯片进行凝胶细胞微球实验，主要涉及到两种生物相料和微流控芯片通道的材料。目前，可供选择的用于细可分为两大类：合成材料和天然材料。天然基质材料中Sodium alginate）、基质胶（Matrigel）、胶原 I（Colla；合成基质材料有聚已内脂（PCL）、聚乙二醇（PE的制作材料有很多种，大致分为无机材料和有机聚合物、玻璃等无机材料；聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧，聚二甲基硅氧烷，即 Poly(dimethyl siloxane)（PDMS流控系统中最常用的材料。PDMS 作为芯片的通道材性、可高温高压灭菌以及良好的透气性等特征，为细胞
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TN492;R73-33

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