激光扫描共聚焦控制系统的研制及高信噪比光片荧光成像理论的研究
发布时间：2020-09-27 11:07
远场光学显微镜可以实现对活体生物组织和细胞的远场、无损伤、非侵入及实时的探测和成像,对生命科学发展起着重要的作用。激光扫描共聚焦显微镜是目前研究和应用最广泛的设备之一,同时也是进一步研究受激发射损耗显微镜(stimulated emission of depletion,STED)等超分辨成像技术的基础平台。软件控制系统是共聚焦显微镜正常工作的核心部件,本论文主要对激光扫描共聚焦显微镜的控制系统进行研制,同时考虑构建STED受激发射损耗显微镜的发展需求,对软件控制系统进行了设计和编写。本论文研制的成像软件系统采用模块化系统设计与研制思路,分别实现了扫描控制模块、数据采集模块、系统操作模块、数据处理模块。扫描控制模块采用三维纳米平移台实现对样品的移动,纳米平移台的控制通过调用API接口函数实现纳米级别的精准移动。在实验过程中可采用S型扫描方式和Z型扫描方式对样品进行采样。数据采集模块采用雪崩光电二极管(avalanche photodiode,APD)作为微弱荧光信号的探测器,时间相关单光子计数采集卡(Time-corrected single photon counting,TCSPC)对光子进行计数,采用一种基于时间相关单光子计数采集卡的原理实现可控积分时间的光子采集方法,对APD输出的信号进行像素时间积分。在系统操作模块中,主要研究内容为协调时间相关单光子计数采集卡(TCSPC)和三维纳米平移台的时间同步控制。数据处理模块对每个像素的光子数据进行实时显示,图像构建和数据存储。本论文自主开发的一套智能化点扫描成像系统,实现激光扫描共聚焦成像,协调了三维纳米平移台、TCSPC数据采集卡、单光子探测器的工作,实现扫描方式、光子数采集、数据存储、图像构建各功能模块之间的通讯。贝塞尔光束的光片荧光显微镜因高轴向分辨率、宽视场成像等优势,使得贝塞尔光束成为光片荧光显微成像的重要照明方式,但因为贝塞尔光束的轴向旁瓣较高,引起焦面以外的荧光激发,降低了图像的信噪比。本文针对该问题,提出了一种相减成像的方法去除贝塞尔光束的旁瓣,即将具有类似旁瓣分布的扩展的实心贝塞尔光束和环状贝塞尔光束对样品两次成像,再使用这两个图像进行差分,从而较好的消除了旁瓣,信噪比和对比度得到改善,图像质量也得到了增强。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TH742.64;TP391.41;TN249
【部分图文】：
图 1.1 STED 显微术的原理图，本图摘自文献[24]。2．可逆饱和光学跃迁显微术（RESOLFT）可逆饱和光学跃迁显微术（RESOLFT）和受激发射损耗显微镜的光路类似，在实验中使用可控荧光蛋白[25]，例如 asFP595 作为样品，激发光和损耗光使荧光蛋白 asFP595 从亮态到暗态实现切换。在光路实现中，使用激光扫描共聚焦成像系统的激发光进行激发，添加一路环形焦斑的淬灭光。如图 1.2 所示，光控荧光蛋白 asFP595 使用 568nm 黄光开启和 458nm 蓝光关闭荧光[26]。成像的方法是先用黄光采用激光扫描共聚焦方式激发荧光，再用中心为零点的环形蓝光光斑，使焦点周边被照射区域的荧光分子淬灭至暗态，只留下中心区域的荧光发射区域[27]。不同于 STED 的是，它可以使用激光功率较低的光强来实现荧光的淬灭损耗，降低了光漂泊和光毒性。但是 RESOLFT 只适用于特定的荧光蛋白来标记，因此，在应用方面可选择的荧光探针比较少。
图 1.1 STED 显微术的原理图，本图摘自文献[24]。2．可逆饱和光学跃迁显微术（RESOLFT）可逆饱和光学跃迁显微术（RESOLFT）和受激发射损耗显微镜的光路类验中使用可控荧光蛋白[25]，例如 asFP595 作为样品，激发光和损耗光使 asFP595 从亮态到暗态实现切换。在光路实现中，使用激光扫描共聚焦的激发光进行激发，添加一路环形焦斑的淬灭光。如图 1.2 所示，光控 asFP595 使用 568nm 黄光开启和 458nm 蓝光关闭荧光[26]。成像的方法光采用激光扫描共聚焦方式激发荧光，再用中心为零点的环形蓝光光斑周边被照射区域的荧光分子淬灭至暗态，只留下中心区域的荧光发射。不同于 STED 的是，它可以使用激光功率较低的光强来实现荧光的淬灭损了光漂泊和光毒性。但是 RESOLFT 只适用于特定的荧光蛋白来标记，因用方面可选择的荧光探针比较少。
基态损耗显微术（GSD）设计合适的光路将荧光团搁置在亚稳态状态场光学荧光显微镜中突破衍射极限[27-30]。GSD 也是在激光扫描共聚焦基础上，加入一路损耗光路。首先利用中心零点的环形损耗光辐照样周围的荧光分子激发至激发态，而处于激发态上的荧光分子将以一定的间系过渡，跃迁至处于较长寿命的亚稳态 T1（三重态）上。随后，再束共聚焦激发光将中心处于基态的荧光分子激发到激发态，将荧光发射斑中心附近，从而压缩了荧光光斑的点扩散函数（point spread fu，实现超分辨成像。GSD 的能级转换如图 1.3（a）所示，激发光和于一个波长，先用中心零点光强的环形损耗光将荧光由基态0S 激发到，由于激发态上的荧光分子会以一定概率跃迁至亚稳态 T1上，经过很反复激发使得荧光分子再由 S1→T1，处于亚稳态 T1上的时间长达 1-1耗光使环形区域内的荧光处于暗态的期间，再用共聚焦激发光斑辐射使区域的荧光发光，从而压缩荧光的 PSF。GSD 显微系统的超分辨成像 1.4（b）所示，表明系统 PSF 的半高全宽（FWHM）为从共聚焦成像 210nm 压缩至 90nm。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TH742.64;TP391.41;TN249
【部分图文】：
图 1.1 STED 显微术的原理图，本图摘自文献[24]。2．可逆饱和光学跃迁显微术（RESOLFT）可逆饱和光学跃迁显微术（RESOLFT）和受激发射损耗显微镜的光路类似，在实验中使用可控荧光蛋白[25]，例如 asFP595 作为样品，激发光和损耗光使荧光蛋白 asFP595 从亮态到暗态实现切换。在光路实现中，使用激光扫描共聚焦成像系统的激发光进行激发，添加一路环形焦斑的淬灭光。如图 1.2 所示，光控荧光蛋白 asFP595 使用 568nm 黄光开启和 458nm 蓝光关闭荧光[26]。成像的方法是先用黄光采用激光扫描共聚焦方式激发荧光，再用中心为零点的环形蓝光光斑，使焦点周边被照射区域的荧光分子淬灭至暗态，只留下中心区域的荧光发射区域[27]。不同于 STED 的是，它可以使用激光功率较低的光强来实现荧光的淬灭损耗，降低了光漂泊和光毒性。但是 RESOLFT 只适用于特定的荧光蛋白来标记，因此，在应用方面可选择的荧光探针比较少。
图 1.1 STED 显微术的原理图，本图摘自文献[24]。2．可逆饱和光学跃迁显微术（RESOLFT）可逆饱和光学跃迁显微术（RESOLFT）和受激发射损耗显微镜的光路类验中使用可控荧光蛋白[25]，例如 asFP595 作为样品，激发光和损耗光使 asFP595 从亮态到暗态实现切换。在光路实现中，使用激光扫描共聚焦的激发光进行激发，添加一路环形焦斑的淬灭光。如图 1.2 所示，光控 asFP595 使用 568nm 黄光开启和 458nm 蓝光关闭荧光[26]。成像的方法光采用激光扫描共聚焦方式激发荧光，再用中心为零点的环形蓝光光斑周边被照射区域的荧光分子淬灭至暗态，只留下中心区域的荧光发射。不同于 STED 的是，它可以使用激光功率较低的光强来实现荧光的淬灭损了光漂泊和光毒性。但是 RESOLFT 只适用于特定的荧光蛋白来标记，因用方面可选择的荧光探针比较少。
基态损耗显微术（GSD）设计合适的光路将荧光团搁置在亚稳态状态场光学荧光显微镜中突破衍射极限[27-30]。GSD 也是在激光扫描共聚焦基础上，加入一路损耗光路。首先利用中心零点的环形损耗光辐照样周围的荧光分子激发至激发态，而处于激发态上的荧光分子将以一定的间系过渡，跃迁至处于较长寿命的亚稳态 T1（三重态）上。随后，再束共聚焦激发光将中心处于基态的荧光分子激发到激发态，将荧光发射斑中心附近，从而压缩了荧光光斑的点扩散函数（point spread fu，实现超分辨成像。GSD 的能级转换如图 1.3（a）所示，激发光和于一个波长，先用中心零点光强的环形损耗光将荧光由基态0S 激发到，由于激发态上的荧光分子会以一定概率跃迁至亚稳态 T1上，经过很反复激发使得荧光分子再由 S1→T1，处于亚稳态 T1上的时间长达 1-1耗光使环形区域内的荧光处于暗态的期间，再用共聚焦激发光斑辐射使区域的荧光发光，从而压缩荧光的 PSF。GSD 显微系统的超分辨成像 1.4（b）所示，表明系统 PSF 的半高全宽（FWHM）为从共聚焦成像 210nm 压缩至 90nm。
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本文编号：2827787
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