便携式3D打印液滴PCR仪及其在癌症miRNA检测的应用

发布时间：2020-11-15 11:06

　　 miRNA是一类非编码小RNA,在癌症细胞中表达异常,常作为癌症的标志物。miRNAs常见的检测方法有微阵列法,miRNA测序法,PCR。其中PCR是分子生物学研究的一种极其重要的工具,经过多年研究,PCR从定性分析发展为定量分析。为了适用于复杂的实验场景,PCR仪的一个发展方向是设备的便携化,PCR仪便携化的关键是PCR微流控技术。PCR微流控技术分为空间域PCR和时间域PCR,空间域PCR技术反应时间短、和上下游模块易组合的优势,吸引了研究者的兴趣。PCR微流控芯片传统制备技术以软光刻为主,操作复杂、制备时需要大型仪器、技术要求高等缺点制约了它的进一步发展。近年来,一种新的微流控制备技术3D打印技术开始应用于微流控芯片的制备,它的制备过程基本上不需要人工操作,操作简单,并且成本比较低。但是,使用3D打印技术制备PCR微流控芯片的研究较少。本文基于以上研究现状,采用3D打印技术制备液滴PCR微流控芯片,并制备便携式液滴PCR仪,检测癌症细胞中的miRNA。首先,本文设计了四种空间域PCR芯片,探究微流控通道的形状和尺寸设计,初步实验表明电热蛇型PCR芯片具有加热快、加热元件形状易加工、可设置多个循环等优势,所以选用该芯片进行后续研究。进一步计算PCR实验时微流控芯片通道流量,探究持续相和分散相不同流量下液滴的生成性能,实现小的液滴生成。为了在较短时间内完成PCR实验,选定持续相23μL/min,分散相1μL/min为后续实验的流量设置。然后,本文构建了PI加热膜控温系统、加热陶瓷控温系统、筒式加热器控温系统,探究3D打印的PCR微流控芯片在同一流量设置时,三种控温系统下芯片的温度分布情况。对三种控温系统下芯片的温度分布进行红外图像处理,温度值分析后,筒式加热器较快的加热速度,良好的均一性和稳定性的特点,有利于PCR实验成功。因此选用筒式加热器控温系统进行下一步液滴PCR实验。最后,在3D打印制备的便携式液滴PCR仪上进行PCR实验。实现对细菌Lacz基因中100 bp片段的扩增,进一步实验得出3D打印技术制备的便携式液滴PCR仪灵敏度为1 ng/μL。对MCF-7乳腺癌细胞的miRNA-21进行扩增,验证miRNA-21在便携式液滴PCR仪上的扩增,并且筒式加热器高温区域温度设置为105℃,低温区域温度设置为60℃时有最佳实验结果。扩增MCF-10A正常细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞的miRNA-21,凝胶电泳分析扩增产物,通过miRNA-21表达量的不同检测出MDA-MB-231乳腺癌细胞。综上所述,3D打印技术制备的便携式液滴PCR仪成功实现了液滴PCR,并且检测出癌症细胞中的miRNA。不仅证明了3D打印技术制备PCR微流控芯片的可行性,并且实现了PCR仪的微型化。采用3D打印制备便携式液滴PCR仪,还体现了3D打印技术的个性化制作、一体成型等优势。在下一步的研究中,我们将对实验进一步的优化,增加荧光检测模块实现实时检测和分析实验结果。同时,拓展PCR仪的应用场景,发挥它的巨大优势。相信在未来,3D打印技术制备的便携式液滴PCR仪在生物医学领域有广泛的应用。
【学位单位】：西安电子科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TN492;TP391.73;R730.43
【部分图文】：

脊椎动物、无脊椎动物和植物中进化保守，这说明它们。miRNA 由单个基因转录而成，存在基因之间或在蛋白显子基因中[3]。miRNAs 在组织中特异性表达，组织中 疾病的状况相关。成主要是前体 miRNA 的成熟、成熟 miRNA 组装成微目标 mRNA 的翻译来控制蛋白质编码基因的表达[4]，如iRNA通过RNA聚合酶II转录为较长的带帽初级miRN内切核糖核酸酶 III Drosha 酶和 DGCR8 在细胞核内将 酸长的中间茎环结构前体 miRNA（pre-miRNA）[7]。Prtin-5 协助下从细胞核主动运输到细胞质，其次使用 RNr 蛋白，双链反式激活响应 RNA 结合蛋白处理 pre-miR小双链 RNA 结构[8][9]。双链的 miRNA 被展开成为成熟NA 诱导的沉默复合物 RISC 上，复合物导入靶 miRNA13]，开放读码框架和启动子区域[14]。

[29]。这些短 RNA 靶标扩增非常困难，微阵列特异性较低会导致假阳性。图1.2 微阵列法检测 miRNAs[29]另一方面，miRNA 的特性影响微阵列技术在 miRNA 表达分析中的应用。主要有四个原因：第一，miRNA 长度很短，为优化杂交效率提供的序列很少；第二，GC 的含量差异很大，导致杂交的特异性有很大差异；第三，一些 miRNA 的丰度较低；第四，密切相关的 miRNA 家族成员甚至在单个核苷酸上也存在差异。为了解决这些问

图1.3 PCR 法检测 miRNA 原理[35][36]（a）polay（A）法（b）茎环法c. 液滴数字 PCRmiRNA 实现相对定量的主要问题在于缺乏通用和可靠的参考基因[37]。液滴数字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）使用液滴发生装置，将 PCR 样品分散到 2000个 nL 级别的液滴中。PCR 扩增在每个单独的液滴中发生，并且里面的 PCR 实验流程和基于 TaqMan 探针的实时 PCR 类型相似。当 PCR 扩增完成后，读取液滴中 PC结果为阳性的部分。在泊松分布的假设下对参加反应的靶分子拷贝进行计算[38]，如图1.4 所示。ddPCR 的优点是绝对定量，不需要额外的内参基因，检测低丰度靶标的灵敏度更高，而且对扩增反应中抑制剂存在的耐受性有很大提升[39]。与 qRT-PCR 相比，ddPCR 在分析循环 miRNA 方面的技术性能和诊断潜力均表现出明显优势[40]。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 黄海鹏;陶玲;杨宇轩;钱志余;李韪韬;;用于微流控芯片的全波长实时荧光检测系统研制[J];生命科学仪器;2018年06期

2 范一强;王洪亮;张亚军;;低成本聚合物微流控芯片加工技术综述[J];传感器与微系统;2019年05期

3 陈凯丽;刘珍珍;王朋林;郑玲;菅复春;;微流控芯片检测方法及其在畜牧兽医上的应用[J];动物医学进展;2019年05期

4 孙薇;陆敏;李立;张咏适;;微流控芯片技术应用进展[J];中国国境卫生检疫杂志;2019年03期

5 齐云;李晖;米佳;胡少勤;赖凡;张玉蕾;;医用微流控芯片研究进展[J];微电子学;2019年03期

6 范一强;柴东平;黄磊;崔汝兵;张亚军;;微流控芯片的标准化探索与展望[J];标准科学;2019年07期

7 蒋丽莉;郑峻松;李艳;邓均;方立超;黄辉;;基于微流控芯片的体外血脑屏障模型构建[J];中国生物工程杂志;2017年12期

8 孟婷婷;;微流控芯片的发展历程[J];山东工业技术;2018年13期

9 任苹;刘京;蔺日胜;刘杨;黄美莎;胡胜;徐友春;李彩霞;;基于微流控芯片的72重单核苷酸多态性族群推断系统的构建[J];色谱;2018年07期

10 李亚楠;丁伟;;自制简易微流控芯片在中学化学实验中的应用[J];教育与装备研究;2017年08期

相关博士学位论文 前10条

1 朱灿灿;病原体核酸一体化并行检测微流控芯片研究[D];中国科学技术大学;2019年

2 朱近赤;细胞相互作用分析的微流控芯片新方法研究[D];华中科技大学;2019年

3 刘文佳;以碳纳米管为传热介质的红外加热便携式PCR平台的开发与应用研究[D];上海交通大学;2018年

4 冯相松;基于分裂重组与漩涡诱导的被动微混合机理及其应用研究[D];哈尔滨工业大学;2019年

5 熊孟;微流控芯片中聚N-异丙基丙烯酰胺的光图案化制备及其应用研究[D];南京大学;2014年

6 李天婵;肠出血性大肠杆菌快速检测芯片的制备及性能研究[D];哈尔滨工业大学;2018年

7 何子怡;基于核酸表面标记和微流控芯片平台的细胞研究[D];清华大学;2017年

8 胡善文;多功能微流控阵列芯片的制备及其应用研究[D];南京大学;2015年

9 张怡;构建一种用于研究精子趋化特性的多通道浓度梯度微流控芯片[D];武汉大学;2016年

10 李思晳;高频声波集成的微流控芯片用于颗粒的表征与驱动[D];武汉大学;2018年

相关硕士学位论文 前10条

1 陈玲;可穿戴汗液收集微流控芯片的制备及其相关物理参数分析[D];湘潭大学;2019年

2 朱培胤;基于微导能阵列的聚碳酸酯微流控芯片超声键合[D];哈尔滨工业大学;2019年

3 刚泽辉;数字微流控芯片驱动系统设计[D];哈尔滨工业大学;2019年

4 阿里亚·阿不力米提;基于城垛结构的细菌培养芯片及抗生素敏感性分析研究[D];哈尔滨工业大学;2019年

5 田露露;基于微流控芯片技术的仙鹤草抗肝肿瘤药效物质及初步作用机制研究[D];辽宁中医药大学;2019年

6 张晨煜;基于微流控芯片的人淋巴细胞捕获关键技术研究[D];国防科技大学;2017年

7 刘江涛;基于微流控芯片单球探针的捕获研究[D];大连理工大学;2019年

8 于洪建;实时快速调控观测点动态生化信号的微流控芯片系统[D];大连理工大学;2019年

9 焦志强;便携式3D打印液滴PCR仪及其在癌症miRNA检测的应用[D];西安电子科技大学;2019年

10 续小丁;基于3D打印模板支撑的软管微流控芯片及其在连续流体表面增强拉曼散射分析中的应用[D];西安电子科技大学;2019年

本文编号：2884687