微孔式数字PCR荧光芯片的自动对焦

发布时间：2021-07-17 16:12

　　为了快速获取微孔式数字PCR芯片清晰的荧光图像,解决传统方法针对微尺度阵列单元自动对焦存在的计算量大,耗时长等问题,建立了基于像素个数随离焦距离变化特征模型的自动对焦方法。依次取3个彼此间隔相同距离的微孔式数字PCR芯片的荧光图像,通过自适应窗口选取与阈值计算,统计窗口区域内大于阈值的像素个数,代入特征函数计算离焦距离,并通过统计出的3个位置的像素个数值判断离焦方向,继而进行对焦。该方法仅需统计13×13个像素大小的对焦窗口中灰度大于阈值的像素个数,且完成对焦仅需4步,对焦结果完全满足后续计算的清晰度要求,与传统爬山方法相比,对焦步骤数平均减少了51.89%,实现了微孔式数字PCR芯片的准确快速对焦。本文提出的自动对焦方法克服了现有算法计算量大、对焦步骤繁琐的缺点,预测准确、速度快,最大程度上减少样本曝光时间,进而减少荧光的淬灭,为后续计算提供更为原始且精确的图像。 

【文章来源】：光学精密工程. 2020,28(09)北大核心EICSCD

【文章页数】：11 页

【部分图文】：

透镜光学成像模型。

传统的成像理论认为,固定对象成像的综合强度应与聚焦无关[26-27]。因此,图像离焦是一个弥散斑半径逐渐变大,亮度分散的过程,拥有高亮度的像素数也逐渐减少,表现为亮度分布逐渐呈现均匀性,若灰度阈值选取得当,离焦过程中,大于该阈值的像素数逐渐增大,而在准焦时取得最小 值。在本文中,系统的成像对象是完成进样及封装的微孔阵列芯片,芯片上规则排列的微孔,将稀释的dPCR样本溶液分割,一部分微孔内填充有DNA样本,引物及特异性的荧光探针,DNA每扩增一条DNA链,就会产生一个荧光分子。经过热循环的芯片在激光激发的作用下,荧光分子累积的孔呈现高亮度,其他孔亮度则无较大区别。如图2所示,芯片内灰度差异的存在及芯片间灰度差异的存在,使得传统的根据像素灰度梯度差来评价离焦量的自动对焦体系出现了片内差异及片间差异,这就要求其计算窗口需要尽可能大以减少这种误差,从而增加了计算量。

常用的窗口选择算法有,中央区域对焦窗口选择法[28]、多区域对焦窗口选择法、非均匀采样对焦窗口选择法等[29]。这些方法在一定程度上节省了计算时间,在一些领域具有实用价值,但这些方法一旦选定区域后,对焦窗口就固定不变,面对不同的对焦对象及对焦过程中出现的物体偏移情况无法做出有效应对,所以需要根据对焦对象及离焦距离的不同自适应选取对焦窗口以提高对焦精度。基于大于灰度阈值像素数量的自动调焦算法选取对焦对象的步骤为:首先选取视野中心31×31 pixel区域,在该区域中寻找与截取图像边沿相差6 pixel的第一个质心点;以第一个质心点为中心取周围13×13 pixel的区域为对焦窗口;然后所计算该区域的阈值及评价值,获得离焦数据并进行对焦后将会判断是否完成对焦。若是,则结束,若否,则在下一次对焦前再进行一次窗口选取步骤,进而做到自适应窗口选取。根据不同对焦对象自适应选取对焦孔的步骤如图3所示。

【参考文献】：
期刊论文
[1]结核杆菌涂片显微视觉检测系统的自动聚焦[J]. 张从鹏,曹文政,徐明刚,宋来军.  光学精密工程. 2018(06)
[2]用于多孔板细胞分析的自动显微成像系统[J]. 韩西达,王敏,黄强,何永红,周超英.  光学精密工程. 2013(10)
[3]采用最大灰度梯度法实现经纬仪自动调焦控制[J]. 梁敏华,吴志勇,陈涛.  光学精密工程. 2009(12)
[4]临界角法检焦系统的设计[J]. 郝贤鹏,任建岳,邹振书.  光学精密工程. 2009(03)
[5]基于加权邻域相关性的显微镜自动聚焦函数[J]. 王倩,宋恩民,许向阳,刘宏.  光学精密工程. 2008(01)



本文编号：3288509