湖北清江和尚洞真菌群落多样性及真菌诱导草酸盐矿物的形成

发布时间：2018-03-15 20:01

本文选题：和尚洞　切入点：深度测序　出处：《中国地质大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：中国喀斯特面积巨大,约为3.44×106 km~2,占国内陆地面积的27.9%,因灰岩、白云岩等碳酸盐岩分布广泛及受现代季风气候条件的影响,使我国成为世界上洞穴资源最为丰富的国家。洞穴是一种重要的地貌类型,不仅在全球分布广泛,而且其形成与演化负载了丰富的环境变化信息,具有较强的科学价值,在地球科学及微生物学领域日益引起学者的关注。对地球表层系统地下洞穴极端环境中地质微生物多样性及其潜在功能的研究,将为深刻理解生命与环境的相互作用奠定基础。然而,长期以来,国内外对岩溶洞穴地质微生物的研究主要聚焦在以细菌为代表的原核生物方面,对以真菌为代表的真核生物的研究较为有限。洞穴真菌多样性的研究是岩溶生态系统真菌功能分析的基础,但传统方法的局限使得对岩溶洞穴真菌多样性的研究非常薄弱。而且,国内目前尚无对原始岩溶洞穴真菌群落多样性的研究报道,对该环境中真菌的多样性及其潜在的生态功能尚无认识,研究非常滞后。对该黑暗、贫营养的极端环境中真菌多样性的深度挖掘,有利于明确岩溶洞穴环境中真菌群落多样性及其潜在的生态功能,对其深入研究具有重要的生态学意义。因此,本文选取位于湖北省宜昌市长阳土家族自治县渔峡口镇招徕河村清江南岸的原始喀斯特洞穴——和尚洞为研究对象,以空气、沉积物、蝙蝠粪、风化岩壁及滴水五种典型生境的样品为材料,采用微生物分子生态学及矿物学研究方法,系统开展了和尚洞不同生境真菌群落多样性、功能以及典型菌株诱导成矿潜力的研究,获得了洞穴免培养及可培养真菌多样性信息,阐明了洞穴真菌的生态功能,对其潜在的地质作用进行了初步探讨。论文主要进展如下:第一,采用深度测序技术,利用Illumina HiSeq 2500测序平台对和尚洞五种生境样本测序后,共获得778 M数据,1012715条序列。选取2179个OTUs中的代表性序列,用QIIME软件注释后共获得已知的453个属、72个目、19个纲及6个门的真菌。子囊菌门相对丰度为72.75%,占绝对优势,共检测到归属于916个OTUs的573274条序列。其它五个门的真菌丰度相对较低,依次为:担子菌门(10.66%、84614 reads、653 OTUs)、接合菌门(8.02%、63647 reads、54OTUs)、壶菌门(0.14%、1081reads、32 OTUs)、Rozellomycota(0.09%、706 reads、15 OTUs)和球囊菌门(0.06%、498 reads、11 OTUs)。在属水平,相对丰度占前十的属为:青霉菌属(11.21%)、毛壳菌属(6.88%)、Neogymnomyces(5.47%)、曲霉属(2.72%)、Mallochia(1.41%)、裸子囊菌属(1.11%)、被孢霉属(5.92%)、毛霉属(0.94%)、卷霉属(0.86%)和地星属(1.83%)。第二,和尚洞真菌群落丰富度和群落多样性的变化规律趋于一致,由高到低依次为滴水、风化岩壁、沉积物、蝙蝠粪和空气。风化岩壁和空气样本的真菌群落多样性(Chao1指数:P0.01)及丰富度(ACE指数:P0.01;观察物种指数:P0.01)具有显著差异;滴水样品和蝙蝠粪样本间真菌多样性(香农-维纳指数:P0.01;辛普森指数:P0.01)具有显著差异。空气样本和风化岩壁样本真菌群落β多样性(加权Unifrac分析)差异显著(P0.01),PCoA分析一轴贡献值为49.86%,二轴贡献值为17.82%;NMDS分析表明空气样本的真菌群落与其它四类样本明显分开,与PCoA结果一致。LEfSe分析在五种生境中发现25个真菌指示类群,其中7个指示类群其效应值较高(LDA score5,P0.05):风化岩壁中的粪壳菌纲和肉座菌目、滴水中的担子菌纲和伞菌纲、空气中的Penicillium.mallochii和Ascomycota.sp.以及在蝙蝠粪中的爪甲团囊菌目(Onygenales)。揭示和尚洞空气真菌丰度洞底比洞口高;基于深度测序发现粪壳菌纲在岩壁环境中相对丰度最高,是岩壁真菌指示类群,提出粪壳菌纲是岩壁环境栖居真菌主要种群的新认识。第三,分析洞穴真菌群落共存模式,在真菌纲水平的网络中共发现11个纲在真菌网络关系中比较重要,其中担子菌门伞菌纲形成较为独立的一簇,与其它类群都发生广泛联系,中心性最强;粪壳菌纲在网络中分布比较均匀,说明该两纲的真菌对维持网络稳定具有重要作用。五种环境中的真菌类群在FUNGuild注释后,获得的营养类型涵盖了12种营养类型类型,说明在岩溶洞穴环境中的真菌类群较为丰富、营养方式以及功能趋于多样化。腐生营养型为和尚洞真菌的主要营养类型。在蝙蝠粪中,腐生营养型的真菌OTU丰度最高,其次为空气、滴水样、风化岩壁及沉积物;病理营养型的真菌在空气中较高,为17.25%;滴水中最低,为4.63%。另外,共生营养型真菌在滴水中最丰富,占10.48%;蝙蝠粪中最低,占3.11%。植物病原菌类型在病理营养型中占主体地位;未定义腐生真菌及木质腐生真菌在五种不同生境中均占主体地位。第四,采用六种培养基,在和尚洞三种生境共42个样品中分离获得可培养真菌194株,经真菌ITS分子标记鉴定,在95%相似性阈值下划分为41个OTUs,归属于3个门、15个目及33个属。其中,风化岩壁中获得真菌46株,分属于子囊菌门的4个目及7个属;沉积物中分离获得真菌85株,分属于3个门、13个目及28个属;蝙蝠粪中共获得63株,分属于子囊菌门的4个目和7个属。子囊菌门在和尚洞三种生境中均是优势类群,其中青霉菌属相对丰度最高,在沉积物、风化岩壁和蝙蝠粪中分别占40%、54%及52%。MA、CZA、PDA和SDA培养基中分离获得的菌株较多,分别占24%、23%、22%和20%。沉积物样品CFU最高,为(3.6±0.001)×103 CFU·g-1;其次为蝙蝠粪样品,为(9.81±0.07)×102 CFU·g-1;风化岩壁样品CFU最低,为(1.79±0.03)×102 CFU·g-1。另外,在分离获得的33个属中,有16个属与岩溶洞穴已报道的36个真菌属一致;有23个属与之前在碳酸盐洞穴中报道的真菌属一致;发现至今尚未在世界范围岩溶洞穴中报道的10个独特真菌属:Metacordyceps、Stilbella、Paraphaeosphaeria、Myriodontium、Auxarthron、Microdiplodia、Trametes、Bjerkandera、Ceriporia以及Trichosporon。第五,对筛选的典型真菌菌株在实验室条件下诱导形成矿物的能力进行初步探索,发现筛选的真菌菌株在代谢活动中产生草酸,能与溶液环境中的钙离子形成沉淀,经SEM/EDS及XRD对沉淀物形貌和物相进行鉴定,主要为四边形、片状、球形以及典型的四面体草酸钙石。结果说明岩溶洞穴真菌参与自然条件下的岩溶作用,其活动最终会影响碳酸盐岩的稳定性。论文的创新点:以原始喀斯特洞穴——和尚洞为研究对象,利用高通量测序技术获得了较为全面的岩溶洞穴真菌群落多样性信息,揭示了洞穴不同生境真菌指示类群;提出了粪壳菌纲是岩壁环境真菌主导类群的新认识。分离获得至今尚未在世界范围岩溶洞穴报道的10个真菌属,为深刻理解岩溶洞穴真菌多样性及功能提供了科学依据。
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【学位授予单位】：中国地质大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：P642.25;X172

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