环境友好纤维素酶在离子液体—溶剂体系中的应用基础研究

发布时间：2017-10-20 12:06

  本文关键词：环境友好纤维素酶在离子液体—溶剂体系中的应用基础研究

  更多相关文章： 离子液体 纤维素酶 类芽孢杆菌sp.LLZ1 原位酶解 抑制

【摘要】：生物质资源的开发利用是实现可持续发展的重要手段。纤维素是地球上最为丰富的生物质资源之一,离子液体(IL)预处理及原位酶解作为实现纤维素资源有效利用的最新手段,受到广泛关注。然而,当前研究大多使用商品化的真菌纤维素酶,缺少对细菌纤维素酶的开发与利用;同时,IL存在价格昂贵、抑制酶活等缺点。为了克服这些问题,进而提高纤维素原位酶解的可行性,本文主要开展了以下研究:首先,从苏州上方山国家森林公园土壤样品中分离得到110株细菌,通过羧甲基纤维素钠平板初筛和产酶能力比较,得到一株产纤维素酶能力强的菌株,编号为LLZ1。该菌所产纤维素酶以1.00 g/L微晶纤维素为底物,水解24 h后葡萄糖产量达0.13 g/L。通过形态观察和16s rRNA基因序列比对,鉴定该菌属于类芽孢杆菌属(Paenibacillu),与P.cellulosilyticus同源性最高(99%)。其次,在获得纤维素酶产生菌LLZ1的基础上,将二甲亚砜(DMSO)/IL这一更优良的二元预处理溶剂引入纤维素原位酶解体系。考察5种DMSO/IL组合的应用效果后,构建并优化了一套新型水-DMSO/[EMIM]DEP-纤维素酶原位酶解体系。最优条件下微晶纤维素和甘蔗纤维素的转化率分别提高了39.3%和37.6%。DMSO/IL二元溶剂的应用,使IL用量减少70.0%,降低了工艺成本。该体系中LLZ1纤维素酶的最优反应条件为40°C、pH 6.0,与现有其他原位酶解体系相比,反应温度低,pH近中性。因此LLZ1纤维素酶具备节约能耗、环境友好的特点。最后,针对纤维素酶活性普遍受IL抑制的问题,以LLZ1纤维素酶为研究对象,探究天然多样性的纤维素酶在IL体系中的失活机制及改善方法。首先分别以不同纤维素为底物,测定各浓度[EMIM]DEP对酶活的抑制效果,结果表明LLZ1纤维素酶受[EMIM]DEP的抑制具有底物依赖性。随后动力学参数分析显示Km显著升高,表明[EMIM]DEP降低了酶与底物的亲和度。而Vmax变化较小,进一步深入研究证明LLZ1纤维素酶在更高底物浓度时受到的抑制更小。接着SDS-PAGE酶谱分析显示在低于30.0%的[EMIM]DEP中内切β-葡聚糖酶表现为可逆失活;在高于40.0%[EMIM]DEP中开始出现不可逆失活。LLZ1产生的不同内切β-葡聚糖酶对[EMIM]DEP耐受能力有所差异。最后,添加金属离子和表面活性剂有助于改善[EMIM]DEP溶液中的酶活力,0.7 mM的Ca~(2+)和0.5‰的Tween80分别使酶活力提高31.2%、48.4%。本文的研究为生物质转化利用提供了技术支撑;为探索纤维素酶在离子液体体系中的活性变化提供了理论依据。
【关键词】：离子液体 纤维素酶 类芽孢杆菌sp.LLZ1 原位酶解 抑制
【学位授予单位】：苏州科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8;O645.1
【目录】：

• 中文摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1.1 引言12
• 1.2 纤维素12-13
• 1.3 纤维素酶13-14
• 1.4 纤维素的预处理14-20
• 1.4.1 离子液体14-15
• 1.4.2 离子液体预处理纤维素15-20
• 1.5 纤维素的酶解20-22
• 1.5.1 酶解策略20-21
• 1.5.2 纤维素酶在离子液体体系中酶活性变化21-22
• 1.6 文章的内容、目的及意义22-24
• 1.6.1 研究主要内容22-23
• 1.6.2 研究目的及意义23-24
• 第二章 纤维素酶产生菌的筛选及分子鉴定24-32
• 2.1 引言24
• 2.2 材料和方法24-27
• 2.2.1 试剂和材料24-25
• 2.2.2 主要仪器25
• 2.2.3 培养基25-26
• 2.2.4 菌种的筛选26
• 2.2.5 菌的电子显微镜观察26
• 2.2.6 16s rRNA基因PCR扩增和序列分析26-27
• 2.3 结果与讨论27-31
• 2.3.1 菌种筛选27-28
• 2.3.2 菌的特征28-29
• 2.3.3 16s rRNA基因PCR扩增和序列分析29-31
• 2.4 本章小结31-32
• 第三章 DMSO/IL预处理纤维素及其原位酶解体系的构建32-42
• 3.1 引言32-33
• 3.2 材料和方法33-35
• 3.2.1 试剂和材料33
• 3.2.2 主要仪器33-34
• 3.2.3 培养基34
• 3.2.4 甘蔗纤维素提取34
• 3.2.5 纤维素的预处理以及原位酶解34
• 3.2.6 原位酶解参数的优化34-35
• 3.2.7 测试分析方法35
• 3.3 结果与讨论35-41
• 3.3.1 离子液体的选择35-36
• 3.3.2 温度和pH对原位酶解的影响36-37
• 3.3.3 DMSO/[EMIM]DEP比例对原位酶解的影响37-38
• 3.3.4 DMSO/[EMIM]DEP浓度对原位酶解的影响38
• 3.3.5 原位酶解的时间进程38-41
• 3.4 本章小节41-42
• 第四章 类芽孢杆菌sp. LLZ1纤维素酶在IL溶液中的稳定性42-52
• 4.1 引言42-43
• 4.2 材料和方法43-45
• 4.2.1 试剂和材料43
• 4.2.2 主要仪器43-44
• 4.2.3 培养基44
• 4.2.4 纤维素酶活性分析44
• 4.2.5 酶促反应动力学分析44
• 4.2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳44-45
• 4.3 结果与讨论45-51
• 4.3.1 [EMIM]DEP对LLZ1纤维素酶活性影响45-46
• 4.3.2 [EMIM]DEP对酶促反应动力学参数的影响46-47
• 4.3.3 类芽孢杆菌sp.LLZ1纤维素酶的天然多样性47-49
• 4.3.4 [EMIM]DEP对LLZ1天然多样性纤维素酶抑制机理49
• 4.3.5 [EMIM]DEP体系中LLZ1纤维素酶活性的改善49-51
• 4.4 本章小节51-52
• 第五章 结论与展望52-54
• 5.1 主要结论52-53
• 5.2 展望53
• 5.3 本文的创新点53-54
• 参考文献54-62
• 致谢62-63
• 附录63-65
• 作者简介65

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