隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备及电化学阻抗免疫传感器的组装

发布时间：2017-10-25 06:43

  本文关键词：隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备及电化学阻抗免疫传感器的组装

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【摘要】：隐性孔雀石绿是三苯甲烷类化学物孔雀石绿在生物体内的主要代谢产物和存在形式,残留时间长,由于其潜在的高毒、高残留、“三致”等毒副作用,很多国家,包括我国已经严格限制其使用,但是违规添加事件屡有发生,给人类健康带来严重威胁。因此,极有必要建立隐性孔雀石绿及孔雀石绿的快速准确的检测方法,得到科学即时的结果,这样才能实现有效监督,保障和促进我国水产品行业的发展。本文研究的具体内容如下:根据化学合成原则和半抗原设计要求,采用以原料为基础,从源头进行合成的方法,合成了四种含不同基团和长度连接臂的半抗原,并且提出了一种新的隐性孔雀石绿半抗原的合成路径,以纯碳链作为连接臂,并可以通过更换反应物实现连接臂的延长。对设计合成的目标产物分别进行薄层色谱法、质谱扫描和核磁氢谱鉴定,证实已成功制备隐性孔雀石绿半抗原,且纯度均在95%以上。将设计合成的半抗原分别通过碳二亚胺法与BSA和OVA偶联,并且经过紫外光谱和MALDI-TOF-MS对完全抗原进行鉴定和偶联比的计算,结果表明完全抗原制备成功,且免疫原的偶联比介于10:1~20:1之间。选用适龄兔进行多克隆抗体的免疫制备,用ELISA方法检测得到的抗血清的效价和灵敏度,确定反应终点。选用效果最好的抗血清,进行ELISA工作条件的优化,建立隐性孔雀石绿酶联免疫吸附分析方法。结果表明,建立的隐性孔雀石绿ELISA检测方法的灵敏度为2.21 ng/mL,线性范围为0.15~31.7 ng/mL,最低检测限为0.06 ng/mL,并用于鱼肉样品的实际检测中,回收率为79.8~92.4%。选用优化得到的抗体进行电化学阻抗免疫传感器的组装,并用电化学阻抗谱进行定性和定量分析。通过对苯二胺重氮化修饰玻碳电极,将蛋白还原的纳米金簇共价连接到电极表面,并用EDC/NHS作为活化剂,将隐性孔雀石绿多克隆抗体以共价连接的方式固定到了修饰过的玻碳电极表面,BSA封闭,以减少非特异吸附对检测结果的影响。根据抗体抗原特异性反应前后电极表面电阻值的变化对隐性孔雀石绿进行了检测,检测限为0.03 ng/mL,检测范围是0.1~10 ng/mL,并且具有较好的稳定性和重现性,可以实现水样中隐性孔雀石绿和孔雀石绿的检测。
【关键词】：隐性孔雀石绿 孔雀石绿 多克隆抗体 酶联免疫吸附法 电化学阻抗免疫传感器
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.1;TP212.2
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-15
• 第一章 引言15-24
• 1.1 隐性孔雀石绿概况15-16
• 1.2 隐性孔雀石绿和孔雀石绿检测技术研究进展16-18
• 1.2.1 样品的前处理16
• 1.2.2 常用的检测方法16-18
• 1.3 电化学阻抗谱（EIS）技术18-22
• 1.3.1 电化学阻抗谱的基本原理18-20
• 1.3.2 电化学阻抗谱分析法在生物传感器中的应用20-22
• 1.4 本实验的研究内容和目的22-24
• 第二章 隐性孔雀石绿半抗原的合成与鉴定24-32
• 2.1 前言24
• 2.2 实验材料24-25
• 2.2.1 主要实验试剂24
• 2.2.2 主要仪器设备24-25
• 2.3 实验方法25-29
• 2.3.1 隐性孔雀石绿半抗原I的合成25-26
• 2.3.2 隐性孔雀石绿半抗原II的合成26
• 2.3.3 隐性孔雀石绿半抗原III的合成26-27
• 2.3.4 隐性孔雀石绿半抗原IV的合成27-29
• 2.4 实验结果和分析29-31
• 2.4.1 半抗原I的合成结果鉴定29-30
• 2.4.2 半抗原II的合成结果鉴定30
• 2.4.3 半抗原III的合成结果鉴定30-31
• 2.4.4 半抗原IV的合成结果鉴定31
• 2.5 本章小结31-32
• 第三章 隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备及酶联免疫吸附法的建立32-44
• 3.1 前言32
• 3.2 实验材料32-33
• 3.2.1 主要实验试剂32
• 3.2.2 主要溶液配制32-33
• 3.2.3 主要仪器设备33
• 3.3 实验方法33-36
• 3.3.1 隐性孔雀石绿免疫原与包被原的制备33
• 3.3.2 人工抗原的检测及结合比的测定33-34
• 3.3.3 隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备34-35
• 3.3.4 抗体的纯化与灵敏度测定35-36
• 3.3.5 抗血清的特异性鉴定36
• 3.3.6 样品前处理36
• 3.4 实验结果和分析36-43
• 3.4.1 人工抗原的鉴定及结合比的测定36-38
• 3.4.2 抗血清效价的测定38
• 3.4.3 包被抗原对间接ELISA的影响38-39
• 3.4.4 抗体纯化结果鉴定及标准抑制曲线的建立39-40
• 3.4.5 隐性孔雀石绿多克隆抗体交叉性分析40-41
• 3.4.6 实际样品的检测41-43
• 3.5 本章小结43-44
• 第四章 隐性孔雀石绿电化学阻抗免疫传感器的组装44-53
• 4.1 前言44
• 4.2 实验材料44-45
• 4.2.1 主要实验试剂44
• 4.2.2 主要试验仪器44-45
• 4.3 实验方法45-46
• 4.3.1 BSA还原的纳米金簇（BSA-AuNCs）的制备45
• 4.3.2 免疫传感器的组装45-46
• 4.3.3 电化学检测46
• 4.3.4 样品收集和前处理46
• 4.4 实验结果和分析46-52
• 4.4.1 重氮化修饰电极和BSA-AuNCs的表征46-47
• 4.4.2 免疫传感器组装过程的表征47-49
• 4.4.3 隐性孔雀石绿抗体的浓度和孵育时间优化49
• 4.4.4 免疫反应中孵育时间和pH值优化49-50
• 4.4.5 免疫传感器对抗原的响应50-51
• 4.4.6 免疫传感器重现性和稳定性的测定51
• 4.4.7 分析应用51-52
• 4.5 本章小结52-53
• 第五章 结论53-55
• 5.1 工作结论53
• 5.2 工作展望53-55
• 参考文献55-62
• 附录62-68
• 致谢68-69
• 作者简历69-70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 JIANG Yousheng;CHEN Li;HU Kun;YU Wenjuan;YANG Xianle;LU Liqun;;Development of a Fast ELISA for the Specific Detection of both Leucomalachite Green and Malachite Green[J];Journal of Ocean University of China;2015年02期

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本文编号：1092555