功能性聚合物的定点修饰对增强蛋白质稳定性的研究

发布时间：2017-10-27 03:05

  本文关键词：功能性聚合物的定点修饰对增强蛋白质稳定性的研究

  更多相关文章： 聚合物 蛋白质偶联物 定位修饰 生物学活性及稳定性

【摘要】：蛋白质作为生物体内不可或缺的组成成分,不仅是专一高效的催化剂,而且可作为用于疾病的诊断和治疗的活性药物。虽然蛋白质在生物学反应,酶工程,分子生物学以及临床治疗中应用广泛,但由于蛋白质自身结构的复杂性和脆弱性往往在复杂的应用环境中表现出较差的稳定性和生物学活性,使得蛋白质的应用受到了一定的限制。如何有效提高蛋白质在复杂环境中的活性及稳定性迫在眉睫,同时也是拓宽蛋白质应用范围的关键问题所在。其中利用聚合物对蛋白质进行修饰从而提高蛋白质的性能得到越来越多科研工作者的关注。为此,本论文利用可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合以及合成化学制备出一系列不同类型、不同链长且末端带有吡啶二硫酯基团的功能性聚合物,与蛋白质无机焦磷酸酶(PPase)上特定位点突变的半胱氨酸巯基进行反应制备得到聚合物-蛋白质偶联物,系统地研究了聚合物-蛋白质偶联物在不同环境因子改变的条件下的生物活性及稳定性,并进一步探讨了聚合物-蛋白质偶联物在生物催化反应和生物医学中的应用。具体研究内容如下:首先,利用基因定点突变技术在PPase活性中心附近的148位赖氨酸残基突变成半胱氨酸残基,构建了无机焦磷酸酶单点突变体K148C,并与RAFT聚合制备获得的不同链长的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)结合形成偶联物PNIPAM-PPase。温敏性聚合物PNIPAM的修饰使得PPase的温度耐受阈值显著提高,其最适反应温度由未修饰酶的45oC提升至60oC;同时,蛋白质的高温耐受能力和热稳定性也明显改善,当修饰的PNIPAM分子量达到66 000时,偶联物在60oC下孵育3小时,其活性保留有77%左右,是未修饰酶的6.8倍。研究结果显示了偶联物PNIPAM-PPase在高温条件下优异的温度耐受性和热稳定性,为蛋白质在体外不利的高温条件下保持较高的生物活性和稳定性提供了新的研究策略。然后,我们进一步探讨了偶联物PNIPAM-PPase在生物酶催化反应中的应用。聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学和基因工程的关键技术,在生物工程与临床诊断中至关重要。但因该反应副产物焦磷酸根(PPi)的积累会阻碍反应向正方向的顺畅进行,使得反应效率降低。而传统分解PPi的方法无法适应PCR长时间的高温反应条件。因此,我们将制备的PNIPAM-PPase偶联物引入到PCR反应中,通过分解PCR反应过程中生成的PPi,在不影响反应特异性的情况下,使得PCR反应效率提高了1.5倍,达到显著促进PCR的效果。不仅如此,偶联物在PCR的高温且长时间循环的反应环境中仍能保持很高的分解PPi的活性,当循环次数达到100次时,偶联物能保留大约78%的活性。该策略为实现蛋白质在不利的高温环境下保持有效的生物学活性和稳定性提供了可行的途径和有意义的探索。最后,考虑到PNIPAM为外源性聚合物存在生物相容性的问题,在体内应用方面可能存在一定的限制,因此我们进一步地探究聚糖的修饰对蛋白质的生物学活性的影响。通过相同的策略制备糖聚物-蛋白质偶联物从而模拟糖蛋白。我们利用甲基丙烯酰氯与氨基葡萄糖的酰胺化反应制备出一种乙酰氨基葡萄糖(Glc NAc)的单体类似物甲基丙烯酰胺葡萄糖(MAG),并通过RAFT聚合制备了一系列不同分子量的糖聚物(PMAG)。利用定点突变技术获得突变体N124C,制备出糖蛋白类似物(PMAG-PPase)。糖聚物的引入极大地提高了蛋白质的活性,且表现为较小分子量的糖聚物显示出较高的活性,当修饰的分子量为8 000的PMAG时,蛋白质的活性提高至14.12±0.66 kat/kg。不仅如此,与天然糖蛋白效果类似,偶联物在较强酸碱溶液,高盐溶液以及蛋白酶等复杂条件下同样表现出优异的稳定性;与此同时,得益于糖聚物独特的C-C主链结构,PMAG-PPase能够有效避免天然糖蛋白所无法避免的糖苷酶的降解,显示了其独特的优势。而且,通过蛋白质自身能够有效分解PPi的特点,PMAG-PPase能够有效水解焦磷酸钙,从而在治疗焦磷酸钙沉积病(CPDD):类痛风这一疑难杂症中具有巨大的潜力。这种糖蛋白类似物在生物检测和临床治疗中显示出极高的价值。综上所述,通过定点修饰的方式构建了一系列不同类型不同链长的聚合物-蛋白质偶联物,系统地研究了蛋白质在不同环境下的活性和稳定性的影响情况,总结出一些经验和规律,并在生物学反应及疾病诊疗得到了初步的应用。通过功能性聚合物的定位修饰从而增强蛋白质的稳定性能够在生物工程及临床诊断中拥有良好的应用前景。
【关键词】：聚合物 蛋白质偶联物 定位修饰 生物学活性及稳定性
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O631;TQ931
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 第1章 绪论13-26
• 1.1 聚合物-蛋白质偶联技术的研究进展13-14
• 1.2 聚合物-蛋白质偶联物的制备策略14-21
• 1.2.1 “Grafting to”策略15-18
• 1.2.2 “Grafting from”策略18-21
• 1.3 聚合物对蛋白质的活性调控21-23
• 1.3.1 PEG类偶联物21
• 1.3.2 刺激响应性偶联物21-22
• 1.3.3 仿生型偶联物22-23
• 1.4 聚合物-蛋白质偶联物的应用23
• 1.5 课题的提出23-26
• 1.5.1 研究目的及意义23-25
• 1.5.2 研究内容及实验方案25-26
• 第2章 温度响应性聚合物对蛋白质热稳定性的研究26-41
• 2.1 引言26-27
• 2.2 实验部分27-34
• 2.2.1 材料与试剂27-28
• 2.2.2 实验仪器28-29
• 2.2.3 构建K148C PPase突变体29-30
• 2.2.4 NIPAM的RAFT聚合30
• 2.2.5 PNIPAM的吡啶二硫酯功能化30-31
• 2.2.6 聚合物的表征31-32
• 2.2.7 PNIPAM-PPase偶联物的制备32
• 2.2.8 低临界共溶温度（LCST）的测定32
• 2.2.9 自由巯基密度32-33
• 2.2.10 PPase及偶联物的活性测定33-34
• 2.2.11 蛋白质及偶联物的活性温度曲线以及热稳定性的测定34
• 2.3 结果与讨论34-40
• 2.3.1 PNIPAM的合成以及偶联物的制备34-38
• 2.3.2 偶联物的活性温度曲线38-39
• 2.3.3 偶联物的热稳定性研究39-40
• 2.4 本章小结40-41
• 第3章 偶联物增强的聚合酶链反应41-48
• 3.1 前言41-42
• 3.2 实验部分42-45
• 3.2.1 材料与试剂42
• 3.2.2 实验仪器42-43
• 3.2.3 PNIPAM-PPase增强PCR43-44
• 3.2.4 PCR扩增44
• 3.2.5 PNIPAM-PPase在不同扩增条件下的稳定性研究44-45
• 3.3 结果与讨论45-46
• 3.4 本章小结46-48
• 第4章 糖聚物对蛋白质在复杂环境下的稳定性研究48-65
• 4.1 前言48-49
• 4.2 实验部分49-55
• 4.2.1 材料与试剂49-50
• 4.2.2 实验仪器50-51
• 4.2.3 N124C PPase突变体的构建51
• 4.2.4 甲基丙烯酰胺葡萄糖（MAG）的合成51
• 4.2.5 MAG的RAFT聚合51-52
• 4.2.6 PMAG的吡啶二硫酯功能化52
• 4.2.7 聚合物的表征52-53
• 4.2.8 PMAG-PPase偶联物的制备53
• 4.2.9 自由巯基密度53
• 4.2.10 PPase及偶联物的活性测定53
• 4.2.11 蛋白质及偶联物稳定性的测定53-54
• 4.2.12 PMAG-PPase水解焦磷酸钙（CPP）实验54-55
• 4.3 结果与讨论55-64
• 4.3.1 糖聚物的合成以及偶联物的制备55-58
• 4.3.2 糖聚物的修饰对PPase的活性影响58-59
• 4.3.3 偶联物在不同p H值下的活性变化59-60
• 4.3.4 偶联物在高盐溶液中稳定性情况60-61
• 4.3.5 偶联物抗蛋白酶水解效果的研究61-62
• 4.3.6 偶联物耐糖苷酶糖解效果的研究62-63
• 4.3.7 偶联物催化焦磷酸钙（CPP）水解效果的研究63-64
• 4.4 本章小结64-65
• 第5章 论文总结与展望65-68
• 5.1 论文总结65-66
• 5.2 展望66-68
• 参考文献68-77
• 硕士论文工作期间科研成果77-78
• 致谢78-80

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