均相电化学及荧光生物传感新方法在癌症标志物检测中的应用研究
本文关键词：均相电化学及荧光生物传感新方法在癌症标志物检测中的应用研究
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【摘要】：癌症是威胁人类生命的主要疾病之一,在临床医学中大部分癌症到晚期才能确诊,如果能够实现早期诊断,可以有效控制病情,降低死亡率。近年来,癌症标志物的发现为癌症的早期诊断提供了可能,针对癌症标志物的检测已成为分析化学领域的重要发展方向。均相DNA生物传感器具有简单快速、灵敏度高、稳定性强、生物相容性好等优点,被广泛应用于基因分析、疾病诊断等领域。本论文利用核酸分子构建了均相DNA生物传感器,实现了癌症标志物的高灵敏检测。系统介绍了DNA生物传感器的基本结构和检测原理,并重点介绍了电化学和光学DNA生物传感器。进一步概述了核酸扩增技术,并对DNA甲基转移酶、端粒酶和microRNA进行了介绍。基于甲基化引发的核酸外切酶Ⅲ辅助等温自发循环信号放大策略,构建均相电化学生物传感平台,实现DNA甲基转移酶活性的便捷、高灵敏检测。在DNA甲基转移酶作用下,双链DNA发生甲基化过程,被Dpn I识别并切割,释放出单链DNA,在核酸外切酶Ⅲ辅助下引发循环切割过程,释放出大量亚甲基蓝(MB)标记的短链DNA,扩散到电极表面,实现电化学信号的放大。该策略实现了DNA甲基转移酶活性的超灵敏检测,检测限可达0.004 U/mL,比文献报道低1-2个数量级。基于核酸外切酶T7辅助循环信号放大策略,首次建立了单细胞水平端粒酶活性均相电化学检测新方法。当端粒酶存在时,5'端标记MB的发卡探针与延伸序列杂交,触发核酸外切酶T7辅助的循环放大过程,释放出大量亚甲基蓝(MB)标记的短链DNA,扩散到电极表面,实现电化学信号的放大。该项研究可检测到单个HeLa细胞中的端粒酶活性,实现了单细胞水平端粒酶活性的均相电化学检测。基于目标物触发杂交链式反应(HCR),首次构建了免酶、免标记均相电化学生物传感平台,实现了高灵敏miRNA电化学检测。目标miRNA可以触发两个亚稳态发夹间的HCR,形成含有多个G四联体的双螺旋DNA长链,MB嵌插入G四联体及DNA双链后,其扩散到电极表面的能力明显减弱,导致电化学信号减小,从而实现了“关信号”miRNA均相电化学检测。该方法免酶、免标记,具有灵敏度高、选择性好、简单、便捷、成本低等突出优点。基于等温指数放大策略,利用氧化石墨烯吸附单链核酸并保护miRNA免受酶水解的性质,建立了免标记荧光检测miRNA的新方法。发夹DNA与目标miRNA杂交,引发DNA聚合与链置换反应,实现目标物循环过程。形成的双链DNA被内切酶识别并切割,产生与目标miRNA具有相同序列的触发DNA,引发新的链增长过程,从而实现目标miRNA的循环等温指数放大。SG嵌插入形成的双链DNA后,荧光信号显著增强。由于采用了免标记策略,避免了昂贵且繁琐的标记过程,该方法还具有简单、成本低等优点。
【学位授予单位】：青岛农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.1
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，本文编号：1167960
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