菌株Pseudomonas koreensis UVCN18的聚-β-羟基丁酸酯聚合酶基因的克隆与表达

发布时间：2017-11-14 04:00

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【摘要】：PHA(聚羟基脂肪酸酯)是微生物在碳氮比失衡的条件下,在胞内合成的一种聚酯,这种聚酯可以作为碳源和能源在胞内积累。PHB是至今为止PHA家族中研究最多、最彻底的典型成员,具有良好的生物降解性、生物相容性和热加工特性,其分解产物可全部被微生物所利用,对环境不会造成任何污染,在环保、医药、农业、工业和食品等领域具有十分广阔的应用前景。但由于生产PHB菌种产率低、底物转化率低、工艺复杂、成本高以及产品后续应用型产品开发少等,严重制约了PHB的广泛应用和产业化发展。为了降低生产成本,PHB的生产方法成为研究热点,其中利用微生物基因工程法是目前研究的主要方向,利用大肠杆菌作为表达菌株,构建工程菌,不仅利用大肠杆菌具有生长迅速,培养基原料来源广等优点,而且基因工程菌株生产PHB大大提高了产率,显示出巨大的开发潜力。本研究以菌株Pseudomonas koreensis UVCN18基因组DNA为模板,成功克隆了菌株Pseudomonas koreensis UVCN18中的PHB聚合酶基因。构建出克隆载体pMD18-T-phbC和表达载体pET-28a(+)-phbC,并构建工程菌通过IPTG诱导,表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定,菌株Pseudomonas koreensis UVCN18的PHB聚合酶基因phbC实现了异源蛋白表达。本研究的具体内容如下:(1)根据NCBI上已公布的假单胞菌属的phbC基因设计引物。以菌株Pseudomonas koreensis UVCN18基因组DNA为模板,成功克隆了菌株Pseudomonas koreensis UVCN18中的PHB聚合酶基因。通过生物信息学分析表明,该基因全长为1704bp,通过BlastP序列对比发现,该基因所表达的氨基酸属于PHA聚合酶家族,与菌种Pseudomonas putida(AHG99486)同源性达96%。将获得的基因序列提交到NCBI,得到登录号为KT716020。(2)克隆载体的构建:将所PCR扩增后获得的PHB聚合酶基因目的基因,与pMD18-T载体连接,获得重组质粒pMD18T-phbC,并成功将质粒pMD18T-phbC转入到大肠杆菌JM109中,获得克隆菌株。(3)表达载体的构建:将克隆载体上的PHB聚合酶基因连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建原核基因重组质粒pET-28a(+)-phbC,转化BL21感受态菌株中,通过含有卡那霉素的培养基筛选,获得重组菌株E.coliBL21-pET-28a(+)-phbC。(4)鉴定表达:重组表达菌株E.coliBL21-pET-28a(+)-phbC经诱导剂IPTG诱导后,提取粗酶液,通过SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定,结果与PHB聚合酶分子量63KDa理论相符合,证明实现了异源蛋白表达。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;O633.14

【共引文献】

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本文编号：1183726