茶树咖啡碱生物合成关键酶基因的原核表达及功能验证

发布时间：2017-11-16 12:03

  本文关键词：茶树咖啡碱生物合成关键酶基因的原核表达及功能验证

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【摘要】：咖啡碱是一种黄嘌呤生物碱化合物,作为常见的嘌呤碱,被发现广泛存在于多种植物种中。人类最常食用的含咖啡碱的植物包括咖啡、茶、可可。咖啡碱不仅是茶叶重要的滋味物质,而且是茶叶生物碱的主要组分。尽管咖啡碱对一些特殊人群造成一定负面影响,如孕妇出现自然流产、早产、低体重儿,但是适量的咖啡碱对人体有很多积极作用,如提神醒脑、利尿护肝、促进消化等。全球生产的咖啡碱除一部分应用于工业外,大部分被用于食品和医药行业。化学合成的咖啡碱不仅有毒副作用,而且合成过程中一些物质污染环境,天然提取仍存在设备昂贵、有毒物质残留等问题。生物合成咖啡碱具有无污染、无毒副作用等优点。国内外学者已经基本掌握茶树中咖啡碱生物合成主要途径和供体途径,也为生物合成咖啡碱奠定了基础。具体合成途径是:腺嘌呤核苷酸(AMP)→次黄嘌呤核苷酸(IMP)→黄嘌呤核苷酸(XMP)→黄嘌呤核苷(XR)→7-甲基黄嘌呤核苷(7-MXR)→7-甲基黄嘌呤(7-MX)→可可碱(Tb)→咖啡碱(Cf)。通过分析比对蛋白质空间模型,将咖啡碱合成酶(TCS1)进行定点突变,突变体TMX突变位置与TCS1相比,分别为:TM1(673CGT→CAT);TM2(949GTT→ATG);TM3(811TTT→TGG);TM4(814GCA→CCA)。咖啡碱合成酶突变体TMX的单独表达中,体外活性检测结果显示:TM1只能催化7-甲基黄嘌呤生成可可碱,TM2/3/4均能催化7-甲基黄嘌呤生成可可碱和咖啡碱,但是咖啡碱含量较低(该部分工作由茶叶重点实验室完成)。本研究在TCS1突变体单独表达基础上,构建了四个突变体TMX和咖啡黄嘌呤核苷甲基转移酶(CaXMT)的共表达载体,尝试通过大肠杆菌进行体外合成咖啡碱,并试图寻找合成咖啡碱的廉价底物。论文主要取得以下结果:(1)将CaXMT和TMX串联到同一表达载体pMAL-c5X上,转化至大肠杆菌细胞中进行共表达,制备粗酶液并添加底物XR和SAM,体外酶反应产物经HPLC检测。结果显示,pMAL-CaXMT-TM2/3/4的酶反应产物有可可碱生成,但是均未检测到咖啡碱生成。pMAL-CaXMT-TM1的酶反应产物只有7-MX。(2)表达载体pRSF-Duet1具有双启动子,将CaXMT和TMX先后连接到两个启动子下,转化至大肠杆菌细胞中进行共表达。体外酶反应检测结果显示,pRSF-CaXMT-TM1的酶反应产物为可可碱,pRSF-CaXMT-TM2/3/4的酶反应产物均有咖啡碱生成,且pRSF-CaXMT-TM4的咖啡碱生成量最大,为1.89μg/mL。(3)在茶树嫩叶中克隆次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(TIDH),验证了该酶具有催化次黄嘌呤核苷酸反应生成黄嘌呤核苷酸的活性。本研究均是在大肠杆菌中进行的,其中CaXMT和TMX在pRSF-Duet1中成功进行共表达,可以实现体外合成咖啡碱。TIDH可通过辅酶I(NAD+)催化次黄嘌呤核苷酸生成黄嘌呤核苷酸,即黄嘌呤核苷的前体物质。本研究不仅为构建生物合成咖啡碱的共表达载体奠定了基础,而且为探索咖啡碱生物合成中廉价底物提供了理论基础。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.3

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