壳聚糖诱导下浅玫瑰色链霉菌差异蛋白质组学初步研究

发布时间：2017-12-07 06:30

  本文关键词：壳聚糖诱导下浅玫瑰色链霉菌差异蛋白质组学初步研究

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【摘要】：当外界环境改变时,微生物能改变自身的生理活动以适应坏境,其代谢活动相关蛋白质也会相应变化。浅玫瑰色链霉菌(Streptomyces roseolus DH)是从东海附近土壤中筛选获得的,能以葡萄糖或壳聚糖为唯一碳源,通过不同的代谢和调控机制生长,且在此过程中能产生相关的分解酶,如壳聚糖酶、几丁质酶等,壳聚糖酶(由菌株获得的)是一种内切型酶,对壳聚糖具有分解作用的专一性酶,可以特异性的水解壳聚糖,得到的降解产物壳寡糖具有良好的水溶性且无毒、无热源、无变异性,并具有抗癌、抑菌等生理活性,在农业、食品、医药等领域的应用广泛。目前对壳聚糖诱导S.roseolus的研究侧重于壳聚糖分解酶的分离、鉴定和优化分解酶的发酵工艺等方面,而对该菌株利用壳聚糖的代谢机制缺乏了解,工业化发酵生产壳聚糖分解酶尚存不足。本文首次对壳聚糖诱导S.roseolus的蛋白组学做了初步研究:(1)从纯化菌体全蛋白的方法、上样量、胶条的分离范围和染色方法等方面对S.roseolus菌体全蛋白双向电泳条件进行优化,建立了一套适用于分析其差异表达蛋白的双向电泳技术,即以裂解液[7mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS,2%(v/v)IPG缓冲液、40mmol/L二硫苏糖醇(DTT)和0.5%(v/v)蛋白酶抑制剂]结合超声破碎细胞的方法提取菌体全蛋白,使用2D clean-up试剂盒纯化提取的粗蛋白,去除杂质对等电聚焦电泳的影响,选择分离范围为pH4-7的IPG胶条和80μg的上样量进行等电聚焦电泳,第一向电泳结束后,转移胶条至SDS-PAGE(凝胶浓度为12%)上进行垂直电泳。最后对凝胶进行银染法染色,获得了低背景、高分辨率、适合差异蛋白分析的电泳图谱。对S.roseolus菌体全蛋白进行三次生物学重复实验,利用lmageMaster2D Platinum7.0软件对这三次实验图谱进行分析,重复率为89.4%,表明双向电泳技术经优化后具有较高的生物学重复,能被用于分析S.roseolus菌体蛋白。(2)利用已建立的双向电泳技术,对未诱导和壳聚糖诱导条件下菌体全蛋白进行分离分析,并通过软件对电泳图谱分析,结果显示:在未诱导条件下的S.roseolus总蛋白图谱上可检测到697±25个清晰可供分析的蛋白点;壳聚糖诱导下的菌体总蛋白图谱上可检测到723±14个蛋白点,选取10个在诱导菌株中差异表达量在5倍以上的蛋白点进行质谱鉴定,并通过Swiss Prot2015、Uni Prot以及DAVID等对鉴定结果进行分析发现:延伸因子G、烯醇化酶等蛋白表达量增加。这些蛋白在蛋白合成、糖代谢以及应激反应过程中起重要作用,表明在壳聚糖的诱导下,S.roseolus发生应激反应,生成可分解利用壳聚糖的有关蛋白,促使与蛋白合成有关的蛋白质表达量增大。此外,壳聚糖在菌体内被降解后,降解产物的吸收利用需要通过糖酵解、三羧酸循环等一系列代谢活动,这导致与这些代谢活动有关蛋白的表达量也明显增加,在壳聚糖培养的条件下这些表达差异蛋白维持了S.roseolus的正常生理活动。(3)利用种子液和壳聚糖发酵培养基分别培养S.roseolus,收集上清液进行双向电泳。通过比较三种胞外蛋白纯化方法的效果后,选择TCA-丙酮法进行后续胞外蛋白的双向电泳分析,利用已建立的双向电泳技术,获得未诱导和壳聚糖诱导条件下胞外蛋白电泳图谱并用软件对其进行分析,在未诱导和诱导条件下的图谱上分别检测到391±13和427±10个蛋白点,经匹配和差异分析发现在诱导菌株中有15个蛋白的表达量有显著差异,其中13个蛋白上调,2个蛋白下调,选取10个差异表达量在5倍以上的蛋白点进行质谱鉴定,成功鉴定出7个有效蛋白,通过SwissProt2015、Uni Prot以及DAVID等对鉴定结果进行分析发现:核糖体30S亚基蛋白S13、延伸因子Ts、和苹果酸脱氢酶等蛋白丰度增加,这与壳聚糖诱导下S.roseolus全蛋白差异表达结果一致。本研究获得了有关壳聚糖代谢的蛋白信息,为揭示S.roseolus代谢壳聚糖的途径提供生物学信息,也为其产有关分解酶的机理提供理论依据,从而为其之后的基因改造、产酶能力的提高等研究奠定基础。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936;O636.1

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