木质纤维素降解酶不同结构域结合纤维素能力的定量分析

发布时间：2017-12-15 05:17

  本文关键词：木质纤维素降解酶不同结构域结合纤维素能力的定量分析

  更多相关文章： 纤维素酶 结构域 结合力 Binding电泳 ITC 荧光光谱

【摘要】：将玉米秸秆和小麦秸秆这样的农作物秸秆类生物质资源转化为生物燃料和化学制品,既能减轻秸秆焚烧造成的环境污染,又能增加农民收入。当前秸秆资源化不能大规模推广实现工业化的瓶颈在于纤维素酶的价格昂贵,并且催化效率不高。酶对底物的催化降解包括结合和断键两个过程。酶对底物的识别和结合是催化断键的前提和基础,也是限速步骤。所以结合力大是酶活力高的前提和基础。酶与底物的结合是个物理学过程,不涉及化学键的断裂,结合形成的酶-底物(ES)复合体是瞬态,不稳定,这些因素使得结合力的测定非常困难。本文主要优化了现有的测定糖苷水解酶对底物结合力的高通量表征平台,并对现有的结合力测定方法进行了比较和分析,一定程度上提高了结合力测定的高通量和精准度。在研究中选取了三种具有代表性的纤维素酶结构域,通过三种不同的方法测定了纤维素酶分子中各结构域与底物的结合力,为进一步理解纤维素酶各结构域对底物结合过程的不同贡献指明了方向。本论文的研究工作及主要成果如下：1.优化了现有的糖苷水解酶结合力电泳(Binding电泳)技术,结合图像处理和定量分析,可以定量表征糖苷水解酶对底物的结合力,为高通量快速表征糖苷水解酶的结合力奠定了基础。Binding电泳以活性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术为基础,在配制聚丙烯酰胺凝胶时往胶内加入梯度浓度的底物CMC,在电泳过程中酶与底物不断地结合和分离,电泳完成后通过Quantity One软件对电泳条带的相对迁移率进行提取,并与CMC的浓度进行线性回归,线性拟合的R2值都在0.9以上表明电泳条带的相对迁移率与CMC的浓度具有线性相关性。通过比较多种糖苷水解酶条带相对迁移率随CMC浓度增加的变化程度,可以快速分析和比较不同酶与底物的结合力。本文建立的糖苷水解酶结合力定量表征技术,不仅可以定性分析有催化能力的糖苷水解酶的活性,与底物反浸的方法相结合定量分析酶活力,还可以定量表征糖苷水解酶对底物的结合力。该方法以活性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术为基础,所以样品的需要量少,可以用于木质纤维素降解酶理性改造后的快速筛选过程,因此该技术具有重要的应用价值和实践意义。2.对现有的普遍应用的三种结合力测定方法进行了系统地分析和比较,确定了三种方法的适用范围,为研究蛋白质与碳水化合物之间结合力的测定提供了方法上的指导。本文以测定结合力最为常用的精确度较高的方法——等温滴定量热法(ITC)为切入点,通过对三种有代表性的纤维素酶结构域及其突变体与底物的结合力进行测定,探讨了ITC方法测定结合力的优缺点。ITC通过测定结合过程中的热量变化,就能够准确计算结合常数(Ka)、焓变(ΔH)和熵变(AS),是现在唯一一种能够在单次实验中同时获得酶与底物结合的所有参数的技术。ITC测定的是生物大分子在自然状态下的亲和力,不需要进行修饰。但是利用ITC法进行测定,需要进行多次预实验来探索最合适的实验条件(例如：最适的酶浓度、最适底物浓度等),所以对底物和酶的需求量大,而且滴定过程耗时,不能实现高通量。为了弥补ITC方法的不足,我们建立了结合力电泳(Binding电泳)技术。Binding电泳技术快速、高通量、灵敏度高、不需要进行复杂的预实验,需要的样品量少。只是精确度不如ITC,可以作为使用ITC前的一个普筛工具。研究结果显示,由于碳水化合物结合模块与底物的结合力低,Binding电泳法和ITC法的灵敏度都不能很好地检测其结合力,而荧光光谱的方法可以实现对其较好地检测。荧光光谱的方法是利用酶分子活性中心色氨酸残基与碳水化合物结合导致荧光光谱的变化来进行结合力的测定。此方法灵敏度高于ITC,而且操作简单、耗时少、不需要复杂的预实验。但是荧光光谱的方法是用有效淬灭常数来表征结合力,不能求出像焓变、熵变这样的热力学常数,所以更适合用于不同酶或者突变体与底物结合力的比较。3.通过对纤维素酶三种有代表性的结构域进行生物信息学分析,并用三种方法对各结构域与底物进行结合力的测定,阐明了各结构域对纤维素酶与底物结合过程中的贡献。选取三个有代表性的家族：GH12家族、CBM4家族和CBM1家族为研究对象,通过生物信息学分析,构建了CBM1和CBM4家族的系统发育树,分别分析了三个家族具有的酶活种类,反应了三个家族酶的多功能性。通过对三个家族的活性架构功能区和表面电势进行分析,说明了各家族的底物识别和定位机制；构建了CBM4家族和GH12家族的活性中心序列谱,以及CBMI家族的全序列谱,分析了各家族与底物结合的关键性亚位点,并分析了其中氨基酸的保守性。从活性架构中能够快速筛选对结合或者催化起关键作用的氨基酸残基,为后续的研究做准备。本文通过对三种代表性的纤维素酶结构域与底物结合力的测定得知,CBM1是由三个芳香族氨基酸形成的平面结合到结晶纤维素表面,其结合力要小于结合单根糖链的凹槽结合型的CBM4。对于同是凹槽结合类型的CBM4和GH12家族的EGⅢ, EGⅢ对CMC的结合力是CBM4对CMC结合力的10倍左右,结合活性中心序列谱分析可知,距离底物5A范围内,氢键(由极性氨基酸与底物形成)和π-H作用(由芳香族氨基酸与底物形成)在EGIII中都远多于CBM4。总之,我们分析和比较了三种检测结合力的方法,建立了一种快速高通量表征糖昔水解酶结合力的Binding电泳的方法,为阐明纤维素酶结合和催化机制、纤维素酶的理性设计和改造及优良突变体的快速选择提供了方法和技术上的支持。本文以纤维素酶家族和不同结构域为研究对象,建立了一种以纤维素酶家族为单位,通过对整个家族活性架构的研究快速定位其功能决定性氨基酸的方法,通过对不同结构域结合底物能力的研究,为糖苷水解酶不同结构域重组形成重组酶以适应工业生产提供了新思路。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8

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