专一测定蛋白质的环境敏感型荧光探针的构建及应用研究

发布时间：2017-12-30 22:23

本文关键词：专一测定蛋白质的环境敏感型荧光探针的构建及应用研究　出处：《西北大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：环境敏感型荧光探针的荧光性质会随周围环境的物理化学性质变化而变化。这类探针在极性溶剂中荧光量子产率很低,而在非极性溶剂中具有较强的荧光信号。通常,环境敏感型的荧光探针在水溶液中荧光信号微弱,而蛋白质作为一种生物大分子能够为环境敏感型的荧光探针提供一个疏水性的环境,使得探针的荧光信号升高。在该类环境敏感型荧光染料分子中引入对蛋白质具有识别功能的基团,可实现高灵敏度、高选择性检测特定蛋白质的功能。目前基于该性质开发的荧光分子受到广大科研工作者的广泛关注。邻近巯基蛋白(Vicinal dithiol-containing proteins,VDPs)是指空间含有邻近的一对或多对巯基的蛋白质。生物体内的相邻巯基一般形成于邻近的半胱氨酸残基,VDPs在氧化环境下可以形成分子内或分子间的二硫键,而在还原条件下又能可逆地还原为邻近的巯基。因此选择性检测生物体内临近巯基蛋白仍然是一个难题。文献报道三价砷是蛋白质相邻巯基的特异性识别体,但是三价砷不稳定,在水溶液中很容易被氧化生成五价砷。因此实验中通常将三价砷与乙二硫醇反应,生成相应稳定的五元环化合物。该化合物可选择性的与临近巯基蛋白质结合,而其它单巯基蛋白质及小分子硫醇类物质基本不干扰测定。基于以上原理,我们将三价砷对蛋白质相邻巯基的特异性识别功能与环境敏感荧光染料的性质相结合,构建了荧光增强型的专一测定临近巯基蛋白的荧光探针分子。本论文分为以下三章：第一章绪论。主要介绍了影响敏感型荧光探针的类型,以及该类探针在检测蛋白质方面的应用。在此基础上,提出了本论文的研究思路。第二章苯并吡喃嗡盐F1结构中具有D1-A-D2的推-拉电子体系,因此其荧光信号随溶剂的极性降低而显著增强；此外,由于F1结构中的二甲氨基苯基和二乙氨基能够自由扭转,因此其荧光信号随着粘度升高而增强。基于上述原因,F1是一个对环境具有高度敏感性的荧光团。实验中,我们以苯并吡喃嗡盐F1为母体,以2-(4-氨基苯基)-1,3,2-二巯基砷烷(PAO-EDT)为VDPs的识别基团,设计合成了专一测定VDPs的荧光探针分子FAsH。我们选择还原型牛血清白蛋白(rBSA)作为VDPs的模型蛋白,研究了探针FAsH测定VDPs的响应特性。实验结果表明,FAsH溶液中加入rBSA后,体系在651nm的荧光信号迅速升高,并且在2.5 min左右达到平衡。反应体系的荧光强度与rBSA的浓度在0.06-0.90μM内呈现良好的线性关系,该方法测定rBSA的检出限为0.015μM。第三章本章以7-(二乙氨基)香豆素类衍生物作为荧光团,PAO-EDT作为相邻巯基蛋白质的特异性受体,合成了比率型荧光探针CAsH2。CAsH2在水溶液中呈现双重荧光发射特性,其荧光发射波长分别由ICT (475 nm)和TICT (550 nm)引起。上述两个荧光发射峰的强度在水溶液都较弱,但当CAsH2与rBSA结合以后,其处于极性较低的蛋白质微环境中,因此CAsH2分子内的扭转电荷转移受到抑制,从而导致检测体系在550nm处的荧光显著降低。同时由于体系极性的降低,ICT态发射峰蓝移到468 nm,荧光信号明显升高。根据这一原理,可实现比率型探针检测生物体系中的VDPs.本实验同时还合成了对照分子CAsHl和CAsH3,验证了空间位阻效应和分子内的扭转效应对探针检测VDPs的影响。探针CAsH2对VDPs具有很好的灵敏度和选择性。该方法测定rBSA的线性范围是0-1.2μM,检出限为2.6nM。
[Abstract]:In this paper , the fluorescence signal of environment - sensitive fluorescent probe is very low , and the fluorescence signal of environment - sensitive fluorescent probe is very weak . In this experiment , the influence of steric hindrance effect and torsion effect on VDPs was verified . The linear range of rBSA was 0 - 1.2 渭M and the detection limit was 2.6 nM .

【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3

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