区分成像细胞质膜内脂筏与非脂筏微畴以及专一检测细胞内微环境的新型荧光探针的研制

发布时间：2018-03-24 09:00

  本文选题：脂筏　切入点：聚集　出处：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：细胞内的各种微结构与微环境在复杂的生命过程中起着至关重要的作用。脂筏和非脂筏微区是细胞膜上的两种重要的微结构,脂筏微区在信号转导、病毒侵入、胞吞胞吐、蛋白簇的形成等重要的生理、病理过程中起着重要的作用;非脂筏微区上载有与免疫功能相关的蛋白,与免疫过程、胆固醇稳态调控等重要过程有密切联系。此外,非脂筏微区的失调与动脉粥化等心脑疾病相关,老年痴呆症会引发脂筏微区和非脂筏微区共同发生变化。pH值是细胞内微环境的重要参量,它与蛋白构象转变、酶催化效率有直接关联,为了维持正常的生理功能,细胞质和线粒体、溶酶体这些细胞器内的pH值一直保持在很窄的变化范围内。pH值的异常会导致细胞病变甚至凋亡,也是许多疾病包括癌症的重要特征之一。黏度是决定生物化学反应中的能量和物质传递速率的重要因素,也能直接影响和调控某些生物化学反应的速率。特别是在酶促反应以及涉及到蛋白之间相互作用或跨膜运输的反应中,黏度起着至关重要的作用。细胞内黏度的异常与动脉粥化、糖尿病、老年痴呆症甚至肿瘤等疾病有密切联系。因此对细胞内微结构和微环境的原位、实时观测有着重要的生理学、病理学和诊断价值。荧光成像方法在成像、监测细胞内微结构、微环境方面有着独特优势和重要应用。相比于探测微电极、原子力显微镜、扫描电镜等方法,荧光成像法可以近乎无损地对活细胞内微结构与微环境进行原位、实时、动态观测,这也是生物研究中最需要的。因此对细胞内微结构、微环境的荧光成像,以及相应的荧光探针得到了广泛的研究与发展。例如,人们使用极性敏感的荧光染料改造为能够双色成像脂筏、非脂筏微区的荧光探针;用黏度敏感染料改造为成像脂筏微区的荧光探针;利用分子内电荷转移(Intromo1ecu1ar Charge Transfer,ICT)、光诱导的能量转移(Photo-induced Energy Transfer,PET)等原理设计了 pH值探针;利用黏度敏感的转子型荧光染料对细胞内黏度进行了探测,等等。尽管人们已经做出了大量工作来开发、完善这些这些探针,但是它们在生物成像的应用中依旧均面临着各种限制。例如,目前用于双色成像细胞膜上脂筏、非脂筏微区的探针对两种微区的区分力不够,导致了它们在活细胞膜上很难清晰成像两种微区的精确分布;比例型pH值探针对酸碱环境的区分力不足,导致了在比例成像过程中双通道收集荧光面临一些困难;等等。因此,为了突破这些瓶颈问题,对目前的荧光探针进行改进,特别开发基于新原理的荧光探针至关重要。为了克服极性探针在双色区分成像脂筏、非脂筏微区时所面临的区分度不够的问题,我们利用在聚集态和单体态具有不同荧光颜色的荧光染料,针对脂筏、非脂筏微区在磷脂排布方式上的不同,开发了聚集/单体型的荧光探针。脂筏微区的磷脂排布紧密且有序,非脂筏微区的磷脂排布松散且无序,因此许多荧光分子能够嵌入非脂筏微区,却不能进入脂筏微区。我们在荧光染料上引入两个长烷基链,构造并合成了两个荧光探针2,7-9E-BHVC12和3,6-9E-BHVC12。体外囊泡测试结果表明,它们能够嵌入松散排布的非脂筏微区,呈单体状态,发射出黄色荧光;同时它们不能够进入脂筏微区,长烷基链能够将他们锚定在其表面并在脂筏磷脂的诱导下形成聚集体,发射出红色荧光;从而以黄、红两种荧光双色标记了脂筏、非脂筏微区。特别是,2,7-9E-BHVC12在两种微区上的荧光波长差别高达110nm,远高于目前已报导的基于极性原理的探针(不超过50nm)。因此,探针2,7-9E-BHVC12能够以较高的区分度区分成像两种微区,在活细胞的细胞膜上对这两种微区进行了清晰双色区分成像,并揭示了癌细胞和正常细胞膜上脂筏、非脂筏微区分布的差异。这些结果表明探针2,7-9E-BHVC12具有巨大的应用前景,而这种聚集/单体型探针的设计思路是合理、可行的,可以为接下来的相关探针开发提供参考。另一方面,尽管目前已经有繁多的pH值探针报导,大多数比例型的pH值探针对酸碱的区分度不够(不超过1OOnm),而且双光子比例型的pH值探针报导较少。目前设计pH值探针的原理较为单一,是导致这一现状的最主要原因。为了解决这一瓶颈性问题,我们以一种特殊的pH值调控的环化—开环反应为基础,以咔唑、三苯胺、芘为母体,设计并合成了6个环化—开环型的荧光探针。这些探针在酸性条件下处于开环状态,发射出长波长的荧光;在碱性条件下会发生环化闭环反应,该反应会切断、缩减荧光团共轭体系,从而可以引发荧光团吸收和发射性质的大幅度转变。这6个荧光探针都能以两种荧光波长实现对酸碱环境的区分,然而考虑到探针与共聚焦显微镜和双光子显微镜匹配性,我们筛选出2个双光子比例探针和1个单光子比例型的探针对细胞内的pH值进行检测成像。此外,根据分子结构的不同,这些探针可以靶向线粒体或溶酶体,且具有不同的pKa值。因此,我们成功的使用这些探针对溶酶体内的pH值进行了单、双光子比例成像,对线粒体内的pH值进行了单光子比例成像。特别是,6个荧光探针在酸碱条件下的荧光波长差异都在150nm以上,甚至能达到210nm;探针的染色位置和pKa值也可以通过分子结构的调整而改变;因此,这种环化—开环反应可以作为平台来设计高衬度比例成像细胞内pH值的单双光子荧光探针。转子型的荧光染料具有对黏度响应的性质,它们在低黏度的环境中具有微弱的荧光,在高黏度的环境中具有明亮的荧光。因此,这类荧光分子在高信噪比的成像细胞内黏性结构、成像细胞内黏度变化等应用上具有广阔的发展前景。我们以具有强推电子能力的胺基为给电子基团,以具有强吸电子能力阳离子盐结构为吸电子基团,构建并合成了三个具有D-π-A结构的转子型荧光探针,R-1、R-2和V-1。三个荧光染料都对黏度有明显响应,它们在低黏度的甲醇中荧光微弱,随着甘油组分的增加,荧光明显增强。其中R-1和R-2对RNA有一定的结合力,可以在单双光子显微镜下实现对核仁的高信噪比成像。此外,我们也在双光子显微镜下,用R-2成功地对深层肌肉组织内的核仁进行了成像。考虑到R-1和R-2可以检测黏度的变化,它们有潜力对细胞或组织内核仁的黏度变化进行监测。探针V-1靶向细胞内的线粒体,且对黏度检测灵敏度较高(甘油中的荧光强度是甲醇中的60倍)。因此我们使用V-1在共聚焦显微镜下成功成像了制霉菌素处理所引起的SiHa细胞线粒体内黏度的增加情况。探针V-1可以应用于原位观测线粒体内的黏度变化。对pH值、黏度、极性惰性的单双光子荧光染料可以作为平台来进行荧光探针设计。因此,我们根据在环境敏感染料的设计与合成中得到的经验,设计了对环境惰性的小分子结构的双光子绿光染料。我们将弱给电子效应的官能团和强吸电子效应的结构连接到简单的共轭体系上,得到了具有小分子结构,在低黏度、高极性溶剂中也具有一定量子产率的双光子绿光染料。该染料具有一定的双光子吸收截面(350GM),且分子结构小、膜通透性好,因此具有很好的应用前景。为了验证染料分子在细胞成像中的应用价值,我们在该染料分子的基础上,设计并合成了溶酶体和线粒体探针,并成功对细胞内的溶酶体和线粒体进行了单、双光子成像。两个探针能够在20分钟内透过细胞膜和细胞器膜并成功着色线粒体和溶酶体,证实了它们优秀的膜通透性。另外,染料的毒性较低、单双光子光稳定性较好,是一个优秀的探针设计平台。而这种通过引入弱给电子效应、强吸电子基团来实现双光子长波长发射同时抑制TICT过程的设计思路可以为单双光子染料的构建提供理论和实验基础。总之,我们设计并合成了聚集/单体型探针,实现了双色高衬度成像细胞膜上脂筏、非脂筏微区;利用pH值依赖的环化—开环反应,设计了对酸碱区分度高的pH值探针,实现了对溶酶体、线粒体内pH值的单、双光子比例型成像;设计并合成了分子转子,实现了对细胞、组织内核仁结构的高信噪比成像,以及对线粒体黏度变化的成像;最后发展了一种小分子结构的双光子荧光染料,可作为探针设计平台。这些探针可作为工具对细胞内的微结构和微环境进行深入研究,而探针设计策略和实验结果可为相关探针的设计提供理论和实验基础。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q2-3;O657.3
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本文编号：1657599