虎乳灵芝多糖的多级结构及溶液行为研究

发布时间：2018-04-10 12:37

本文选题：虎乳灵芝 + 多糖　；参考：《华中农业大学》2017年博士论文

【摘要】：虎乳灵芝(Lignosus rhinocerotis)是一种食药两用真菌,具有很高的营养价值和广泛的生物活性,多糖是其中主要活性成分之一。并且,多糖的功能特性(营养、工艺或生物活性)与它们的多级结构(单糖组成、糖苷键、支化度、分支长度、分子量和链构象)及溶液行为密切相关。因此,本论文从虎乳灵芝菌核中提取得到高支化多糖(LRP),对其多级结构(化学结构、分子尺寸和链构象)及溶液行为进行了研究,以期为阐明LRP的精细结构、加工特性及构效关系提供理论依据,也为高支化多糖在食品行业的开发应用奠定基础。本论文主要研究内容及结论如下。采用不同温度的水提法(25℃、95℃和120℃)和1mol/L的NaOH溶液(4℃)从虎乳灵芝菌核中成功得到四种多糖级分(LRP-1、LRP-2、LRP-3和LRP-4),用尺寸排除色谱-多角度激光光散射仪-示差检测仪(SEC-MALLS-RI)、气相色谱仪(GC)、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)及紫外可见分光光度计(UV-vis)分析了四种LRP级分的结构、分子尺寸和链构象,并用环磷酰胺(Cy)诱导的免疫低下模型评价了它们的免疫调节活性。LRP-1和LRP-2是多糖-蛋白质复合物(46 ～ 68% β-D-葡聚糖和27 ～ 48%蛋白质),而LRP-3和LRP-4完全由D-葡萄糖组成。相比于LRP-1、LRP-2和LRP-3, LRP-4具有低分散性、高分子量(Mw,5.86×106g/mol)和高粘度([η],202.6 mL/g)。基于S2z1/2-Mw 的指数β及其“U型”分布曲线,可以得出四种LRP级分皆是一种高支化的大分子,其中LRP-3比LRP-2在水中具有更为紧缩的球形构象。此外,四种LRP级分通过提高免疫器官指数、促进淋巴细胞增殖和刺激重要细胞因子TNF-α和INF-γ的分泌来提高环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的免疫力。采用第二章的提取方法(将NaOH溶液浓度降低至0.5 mol/L)从虎乳灵芝菌核中得到碱溶性多糖(LRP),通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)、FT-IR、GC、1D和2D核磁共振仪(NMR)等仪器结合单糖组成分析、高碘酸氧化、Smith降解(包括可控Smith降解)和甲基化分析表征了 LRP的结构特征。LRP是以(1→3)-β-D-Glcp为主链,每3个葡萄糖残基带有1个(1→6)-链接的高支化侧链,该支链由3个(1→6)-β-D-Glcp残基构成次级主链,且含有2个在03位取代的β-D-Glcp端基。LRP的支化度为0.76,表明其具有高度支化的结构。采用SEC-MALLS-Vis-RI检测得到LRP在25℃下0.25M LiCl/DMSO溶液中的Mw、S2z12、流体力学半径(Rh)和[η]值分别为 2.88×105g/mol、30.36nm、22.34nm 和 131.5mL/g。此外,[η]-Mw的指数α、S2z1/2Mw的指数β、分形维数df及分子参数ρ分别为0.20、0.33、2.50和1.36,证明LRP是一种高支化多糖且在LiCI/DMSO溶液中呈现紧缩线团构象。采用 SEC-MALLS-Vis-RI、马尔文纳米粒度仪(DLS)、FT-IR、UV-vis、圆二色谱仪(CD)、透射电镜(TEM)等仪器并结合刚果红实验分析了超声处理不同时间对LRP稀溶液(1mg/mL)的有序结构、分子参数及链构象的影响,揭示了超声波作用下LRP在水中的分散机制。刚果红实验和CD的结果表明,超声处理0-90min,LRP的有序结构仍然存在。短时间的超声可提高LRP的水溶性,溶液由浑浊变澄清,LRP的各分子参数(Mw、Mn、S2z1/2、[η]和Rh)急剧下降,分子量分布变宽,粒度变小,而长时间的超声会使溶液再次变浑浊,各分子参数趋于平缓,甚至有上升趋势,分子量分布变窄,粒度变大。结合构象参数α([η]-Mw的指数)和β(S2z12-Mw的指数),发现超声处理后LRP的紧凑线团先变松散再变紧密。综上,超声波作用下LRP在水中的分散机制如下:超声前期,LRP溶液中较大的聚集体在空化效应的作用下被分散为一些小线团,溶解性增加,溶液由浑浊变澄清;随超声时间的延长,LRP溶液中的小线团越来越多,由于过度密集和表面效应发生聚集,使溶液又变浑浊。运用流变学的方法研究了浓度对LRP的溶液行为的影响。稳态剪切测试结果表明,LRP/水体系为剪切变稀的假塑性流体,剪切稀释现象随浓度增大而更加显著。基于Cross模型和幂率定律拟合,LRP/水体系从稀溶液到浓溶液的临界转变浓度(也称交叠浓度,c*)为2.65 mg/mL,与通过特性粘数([η],378±32 mL/g)的倒数计算得到的c*值相一致。动态频率扫描和微流变测试显示,LRP/水体系的储能模量(G')与损耗模量(G")随角频率(ω)的增大而增大,且在浓度约为10mg/mL,体系由浓溶液转变为弱凝胶。LRP/水体系的弹性和粘度随浓度的增大而增加,且流动性变差。当LRP/水体系浓度≤12.5 mg/mL时,其更偏向于粘性液体;而当浓度为15和20mg/mL时,其更偏向于弹性固体。当LRP/水体系浓度为8、9和10mg/mL时,动态复合粘度(η*)和稳态剪切粘度(η)的关系符合Cox-Merz准则,浓度过高或过低,都会偏离Cox-Merz准则,表明过高或过低的浓度会导致LRP分子在动态振荡和稳态剪切不同的运动模式下发生了不同程度的分子重排。蠕变-恢复测试显示,不同浓度的LRP/水体系的蠕变段采用Burgers模型拟合得到的瞬时弹性柔量(J0)、延迟弹性柔量(J1)、最大柔量(Jmax)和延迟时间(λ)随浓度的增加而降低,零剪切粘度(η0)随浓度的增加而上升,柔量恢复百分比(R)随浓度的增加从58.51%增大到92.30%,表明体系弹性增强。触变环的面积随浓度的增加而变大,表明浓度对LRP/水体系的触变性影响较大且呈正相关。LRP/水体系的稳定性随浓度的增大而增加,当浓度≥7 mg/mL时,不再发生聚集沉淀的现象。运用流变学的方法研究了 LRP凝胶的自修复性能及温度对其溶液行为的影响。应变(γ)和频率(ω)对LRP体系(15mg/mL)造成的影响是可逆的,被破坏的缠结网络结构能快速地自行修复。并且,LRP/水体系在较大的γ (100%)下由凝胶态转变为粘流态,一旦这个较大的γ被移除后,LRP/水体系又能从粘流态恢复至凝胶态,表明LRP凝胶具有自修复能力。LRP体系在整个升温和降温的过程中一直处于凝胶态,且温度对LRP凝胶的影响是不可逆的。第一次升温过程中,LRP存在玻璃化转变温度(Tg,49.35℃),暗示LRP发生了变性,从有序向无序转变;降温过程体系的粘弹性有所恢复。在第二次升温过程中,G'和G"曲线中的玻璃化转变峰消失,表明已变性的LRP不能恢复至最初的状态,且变性后的LRP凝胶仍具有热不稳定性。经过第一次升温和降温后,LRP凝胶的强度增大,但在经历第二次升温和降温后,其强度减弱。微流变测试发现,只有当LRP/水体系浓度≥9 mg/mL时,才能在一定温度下形成凝胶,而当浓度足够大(≥20 mg/mL)时,其在常温下就已经形成凝胶。运用Arrhenius方程拟合表观粘度(η)与温度的关系计算出流动活化能(Ea),发现在剪切速率(γ)恒定时,随浓度的增大,LRP/水体系的Ea减小,表明LRP/水体系流动性受温度影响越不显著。采用流变仪研究了超声对LRP浓溶液(15 mg/mL)的溶液行为的影响。超声处理前后的LRP/水体系均呈现剪切变稀的假塑性流体特征,随超声时间的延长,LRP/水体系先增稠再变稀。超声处理后的LRP/水体系均呈现与未超声处理相同的弱凝胶性质,随超声时间延长到10 min, LRP凝胶的强度增加到最大值,随后强度减弱。超声处理后的LRP凝胶会更加偏离Cox-Merz准则。超声处理前后的LRP/水体系在升温和降温的整个过程中一直处于凝胶态,且均具有热不可逆性,降温后的LRP凝胶的强度随超声时间的延长而逐渐减弱。超声会使LRP凝胶的Tg向低温移动。γ和ω对超声处理前后的LRP凝胶造成的影响是可逆的,超声处理后的LRP凝胶仍具有自修复能力。LRP凝胶的J0、J0、Jmax和λ值随超声时间的延长先降低再增大,而η0和R值先增大后降低;超声处理10 min能使LRP凝胶的强度增加,弹性响应变快,抵抗外加形变的能力变强,结构恢复率变高。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O629.12

【参考文献】