基于DNA模板化铜纳米簇的生物传感新方法研究

发布时间：2018-04-23 18:53

本文选题：铜纳米簇 + ATP　；参考：《郑州大学》2017年硕士论文

【摘要】：金属纳米簇由于其独特的性能如生物相容性、低毒性、发射波长可调、光稳定性以及高量子产率等,越来越多的受到科研工作者的青睐。目前,金属纳米簇主要以牛血清蛋白蛋白、还原性物质、树枝状大分子、微生物细胞等为模板来合成,而寡核苷酸链由于其特有的分子识别、自组装性能以及优良的纳米尺寸效应等特点,也是一种优良的金属纳米簇的模板。以寡核苷酸链为模板的铜纳米簇由于其制备方法简单、成本低、生物相容性好、绿色环保等优点,而受到人们的广泛关注,但其应用仍然处在初级阶段,因此铜纳米簇还有很大的发展空间和广阔的应用前景。本论文主要以DNA为模板合成的铜纳米簇为出发点,开展了一系列的研究工作。主要研究思路如下:首先,基于三磷酸腺苷(ATP)与其适配体特异性识别的作用,结合富T碱基为模板的荧光铜纳米簇的聚集荧光增强效应,我们设计了一种免标高灵敏检测ATP的新方法。本方法中,我们用富T碱基序列将两段被裂分开的ATP适配体进行延伸,当有ATP存在的情况下,ATP与其适配体结合形成适配体1-ATP-适配体2的复合物,从而将两段可以作为铜纳米簇模板的富T碱基序列拉近,而富T碱基序列能作为模板合成铜纳米簇,同时产生明显的荧光增强效应,且体系的荧光强度随着ATP浓度的增加而增强。基于此,本文建立了一种操作简单、选择性高、成本低的高灵敏检测ATP的方法,线性范围为100 nM-100μM,检测限为10.29 nM。在此基础上,进一步实现了复杂生物体系中ATP的检测,为ATP在分子生物学和生物医学诊断中提供了一种新型的检测方法。其次,基于以发夹状富T碱基为模板的铜纳米簇,我们发展了一种“turn-off”型免标检测T4多聚核苷酸激酶的新方法。少于15个T碱基的DNA序列不能被用作铜纳米簇合成的模板,除非其位于发夹状结构的环状区域。T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)将DNA的5?端磷酸化,基于此,结合λ核酸外切酶对5?端为磷酸基团的双链DNA的识别及消解作用,我们提出了一种简单快速的检测T4PNK的新方法。在没有T4 PNK存在的情况下,λ核酸外切酶不能消解5?端为羟基的发夹状探针,因此能够形成荧光铜纳米簇。当有T4 PNK存在的情况下,发夹状探针的5?端羟基被磷酸化,并被λ核酸外切酶识别消解,发夹状的DNA探针被打开形成直链状的DNA,因此不能有效的合成铜纳米簇,体系的荧光信号大大降低。基于此,本文建立了一种简单易行,绿色环保,成本低廉的检测T4 PNK的方法,线性范围是0.1-20 U/mL,检测限为0.1 U/mL。与文献报道的方法具有一定的可比性,在生物医学领域和临床诊断领域有很大的应用前景。最后,基于双链DNA模板化的铜纳米簇为检测信号,我们设计了一个“turn-on”型的检测T4多聚核苷酸激酶和其抑制剂的新方法。该方法中,我们设计了一个5?端突出,3?端凹陷并被磷酸化的发夹状探针,一旦发夹状探针3?端的磷酸基团被T4多聚核苷酸激酶(T4 PNKP)水解为羟基,就能够在Klenow Fragment(KF)聚合酶的聚合作用下,延伸生成双链DNA,并作为铜纳米簇的模板合成荧光铜纳米簇。基于此,本文实现了对T4 PNKP活性的检测,线性范围为0.1-25 U/mL,检测限为0.067 U/m L,并且对T4 PNKP抑制剂的检测也取得了较好的实验结果。该方法简单、免标、易行,在T4 PNKP的测定及其相关领域中具有很大的应用前景。
[Abstract]:In this paper , we have developed a new method for detecting ATP by using DNA as template . This paper presents a new method for detecting T4 PNK in the presence of T4 PNK .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O657.3

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