荧光素的模拟酶活性及分析应用研究

发布时间：2018-05-03 19:20

本文选题：荧光素 + 类过氧化物酶活性　；参考：《西南大学》2017年博士论文

【摘要】：天然酶,如辣根过氧化物酶(HRP),由于在温和的条件下具有高的催化效率和特异性,已被广泛应用在各个领域,如酶联免疫吸附试验(ELISA)、生物传感器、临床诊断和有机合成等。但天然酶也存在一些固有缺陷,如大规模生产成本高、易受环境变化的影响而失活、变性,因此研究者一直致力于开发能克服上述缺陷的模拟酶。自从2007年阎锡蕴院士研究组首先报道Fe3O4磁性纳米粒子具有类过氧化物酶活性以来,在过去的十年里,纳米酶的构建已经成为研究热点。与天然酶相比,这些纳米酶具有更高的稳定,对极端环境耐受性强,成本低,易于制备、存储和操作。但是它们大多数在水溶液中或高盐条件下长时间放置易于团聚而失去催化活性,因此必须引入表面修饰基团增加纳米酶在溶液中的稳定性。然而这些稳定剂往往会抑制其模拟酶的活性。另外,大部分的纳米酶很难大批量的制备,而且同种纳米酶的催化活性也存在批次间的差异。上述这不足严重制约了纳米酶的应用。因此,寻找能克服纳米酶缺点的新型模拟酶意义重大。我们首次发现,有机小分子物质——荧光素具有过氧化物模拟酶和可见光诱导的氧化物模拟酶活性,并详细研究了催化机理、基团与其模拟酶活性之间的关系。基于荧光素的模拟酶活性,成功构建了检测H_2O_2、三磷酸腺苷(ATP)和羧酸酯酶(CaE)的光度分析新方法。具体内容如下:(1)荧光素的过氧化物模拟酶活性研究我们首次报道了小分子物质荧光素具有过氧化物模拟酶的活性,并用于定量检测H_2O_2。荧光素能催化H_2O_2氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)发生显色反应。催化过程遵循典型的Michaelis-Menten动力学模型。电子自旋共振(ESR)实验结果表明荧光素能催化H_2O_2分解产生·OH。与天然酶相比,在极端的条件下荧光素展现出更好的耐受性和稳定性。荧光素的耐受性使它在生物医学、工业和环境化学等领域具有更广泛的应用。我们的研究开启了从有机小分子物质中筛选模拟酶的新思路。(2)基团对荧光素过氧化物模拟酶活性的影响荧光素作为一种新型的有机小分子模拟酶,其催化活性与结构高度相关。我们系统比较了荧光素、羧基荧光素、氨基荧光素的过氧化物模拟酶活性、电子自旋共振谱(ESR)信号、酶动力学参数和表观活化能,发现羧基可能为底物TMB的结合位点,能增强催化活性。而氨基却抑制其催化反应。这为设计和构建其它有机小分子模拟酶奠定了基础。(3)基于荧光素的过氧化物模拟酶活性比色检测羧酸酯酶基于不同荧光素衍生物过氧化物模拟酶活性差异,我们构建了一种检测羧酸酯酶(CaE)的新方法:荧光素二乙酸酯(FDA)无过氧化物模拟酶活性,CaE可以催化FDA水解产生有过氧化物模拟酶活性的荧光素;生成的荧光素可以催化TMB-H_2O_2发生显色反应。652 nm处的吸光度可以用于CaE的定量检测,线性范围为5 U/L到5000 U/L,检出限低至1.7 U/L。本方法也具有很好的选择性,成功用于胎牛血清(FBS)中CaE活性分析。该研究提出了以有机小分子模拟酶为探针、基于模拟酶活性改变构建分析方法的新思路。(4)荧光素作为过氧化物模拟酶用于ATP检测本章基于ATP显著抑制荧光素的过氧化物模拟酶活性,构建了检测ATP的新方法。由于ATP的磷酸基与荧光素的结合位点(即羧基)结合,降低了其催化H_2O_2氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)发生显色反应的能力,据此用于ATP的高灵敏检测。该方法灵敏度高,检测限低至3.2 n M,线性范围宽(7.5n M-500 n M),成功应用于胎牛血清(FBS)中ATP的检测。该方法简单灵敏,无需标记和抗体等识别物质。(5)荧光素的可见光诱导类氧化酶活性研究我们首次发现了荧光素的可见光诱导类氧化酶活性。在可见光照射下,荧光素能催化典型的显色底物如3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)和2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)氧化并使其发生颜色改变。其催化反应遵循典型的Michaelis-Menten动力学模型,而且荧光素对底物TMB的亲和力比HRP的大。我们阐明了荧光素的催化机理,证实在可见光照射下,O_2~(·-)和h+是荧光素催化TMB氧化过程中产生的主要活性物种。不需要容易分解的H_2O_2,荧光素以溶解氧作为一种温和、绿色的电子受体,而且只需10分钟可见光照射,就能获得很高的催化活性。(6)基团对氧杂蒽染料可见光诱导类氧化酶活性的影响作为一种最常用的氧杂蒽染料的荧光素被广泛应用在诸多领域。我们系统研究了具有相同结构特征的11种典型氧杂蒽染料的光诱导类氧化酶活性并详细探讨了基团对其光诱导模拟酶活性的影响。这11种染料包括荧光素(F)、8种荧光素衍生物,即羧基荧光素(CF)、氨基荧光素(AF)、钙黄绿素(CC)、2’,7’-二氯荧光素(DCF)、氯化荧光素(FC)、荧光素二乙酸酯(FDA)、四碘荧光素(EB)、四溴荧光素(EY)和2种阳离子罗丹明衍生物,即罗丹明B(RhB)和罗丹明6G(Rh6G)。其中除了FDA和FC没有可见光诱导的类氧化酶活性以外,其它9种氧杂蒽染料都有光催化活性。通过系统考察它们的吸收强度和酶动力学参数,我们发现羧基能提高催化效率。氨基的存在会降低其催化活性。羧基和强吸电子基团能增强与底物的亲和能力。氨基和羧酸酯基会减弱与底物的亲和能力。这为设计性能优良的新型可见光诱导模拟酶奠定了基础。(7)荧光素作为可见光诱导类氧化酶用于构建羧酸酯酶比色检测新方法羧酸酯酶(CaE)具有代谢药物、解毒毒素和激活抗癌前药等重要作用,而且血浆中的CaE可作为肝细胞癌的生物标志物,所以超灵敏和高选择性检测血清样品中的CaE活性意义重大。本章利用荧光素的可见光诱导的类氧化酶活性,构建了一种新型的羧酸酯酶比色检测方法:以无光诱导模拟酶活性的FDA为探针,CaE可以催化FDA水解产生具有很强光诱导模拟酶活性的荧光素,以TMB为显色底物,构建检测CaE的检测平台。该方法灵敏度高,检出限低至0.013 U/L,优于现有的光学分析方法;线性范围较宽(0.04至20 U/L);成功应用于胎牛血清(FBS)中CaE活性的检测。
[Abstract]:Natural enzymes , such as horseradish peroxidase ( HRP ) , have been widely used in various fields such as enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) , biosensor , clinical diagnosis and organic synthesis . This paper presents a new method for detecting ATP in fetal bovine serum ( FBS ) . The method is simple and sensitive , the detection limit is low to 3.2 n M , and the detection limit is low to 1.7 U / L . The method is simple and sensitive , the detection limit is low to 3 . 2 n M , the detection limit is low to 1.7 U / L .

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O657.3

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