基于功能化碳纳米材料的CYP450 2C9酶电化学传感器的构建及其介导的药物代谢研究

发布时间：2018-05-16 04:02

  本文选题：电化学传感器 + 碳纳米材料　； 参考：《河北大学》2017年硕士论文

【摘要】：细胞色素P450酶(CYP450)是一种位于内质网膜上的以血红素为活性中心的酶蛋白超级家族,参与生物体内各种外源性和内源性物质的代谢过程。目前在人肝脏中发现了15种CYP450,CYP 2C9是最重要的CYP450亚型之一(约占总CYP蛋白量的20%)。由CYP450 2C9代谢的底物约占总CYP代谢药物的16%,包括阿米替林,氟西汀,氯沙坦,苯妥英和许多非甾体抗炎药。CYP450 2C9还催化人肝微粒体中内源性底物,如花生四烯酸和亚油酸环氧化酶的代谢。CYP450在溶液中的代谢均需要电子供体辅酶NADPH的参与,而NADPH价格昂贵且不易保存,这已成为限制药物体外代谢研究的一个因素。因此人们便尝试将CYP450固定在电极上,用电极替代NADPH为CYP450活性中心提供催化所需要的电子。但是,CYP450酶的活性中心被包埋在蛋白结构中,这使得它与电极之间的电子交换比较困难。因此,人们尝试使用各种纳米材料来加快两者之间的电子传递。在此研究中,我们构建了一种基于各碳纳米材料的第三代CYP2C9生物传感器,无需NAD(P)H或任何介体,可以实现CYP和修饰电极之间的直接电子转移(DET)。此外,我们还研究了CYP2C9对底物的代谢和药代动力学,并用简单廉价的传感体系评估了几类抑制剂对CYP2C9活性的影响。第一章:简单介绍了电化学传感器和CYP450的概念,综述了酶的固定化方法及酶传感器的各种应用。第二章:以SBA-15为模板,乙二胺为氮源,制备了氮掺杂的介孔碳(N-MC)。并以N-MC与纳米金(AuNPs)的复合材料(N-MC/AuNPs)为载体,把细胞色素P450 2C9酶(CYP2C9)成功地固定在了玻碳电极表面,构建了电化学驱动CYP2C9催化甲苯磺丁脲的体系。基于循环伏安法研究了CYP2C9与电极之间的电子传递机制,在扫速为0.02-0.5 V s-1时,其电子转移速率常数为0.26-5.35 s-1。利用安培法测得CYP2C9对甲苯磺丁脲催化的表观米氏常数为153.67μmol L-1。此外,CYP2C9的抑制剂氯霉素对甲苯磺丁脲的代谢过程有明显的抑制作用,其半数抑制浓度值(IC50)为0.515μM。同时,此复合材料导电性高、比表面积大以及良好的边缘效应,具有优异的直接电子转移和生物催化性能,为CYP2C9酶提供合适的微环境。表明了该体系有望成为电化学生物传感器的新平台。第三章:通过非共价修饰和氮原子掺杂方式对石墨烯进行改性,制备了阳离子聚丙烯酰胺功能化氮掺杂石墨烯(CPAM-NG),并将P450 2C9酶固定在滴有此材料的玻碳电极上,成功构建了电化学驱动CYP2C9催化甲苯磺丁脲代谢的传感体系。利用循环伏安法研究CYP2C9和电极之间的电子传递机制,其直接电子转移常数值为1.84 s-1,CYP2C9酶电极对甲苯磺丁脲有积极的电化学响应,表观米氏常数值为117.86μM。借助微分脉冲伏安法,进一步研究了五种抗抑郁药物对CYP2C9催化甲苯磺丁脲的抑制作用,计算出各半数抑制浓度,对研究药物相互作用及临床用药有一定的指示作用。第四章:通过强酸氧化的方式对多壁碳纳米管(MWCNTs)进行羧基化,制备了羧基化的多壁碳纳米管(COOH-MWCNTs)。把CYP2C9通过静电作用和共价键合方式固定在COOH-MWCNTs修饰的玻碳电极上,由于该材料具有导电性和生物兼容性良好、在溶液中分散性好的优点,所以成功构建了CYP2C9催化甲苯磺丁脲的电化学传感器。用循环伏安法(CV)研究了电极和CYP2C9之间的电子传递机制,计算得直接电子转移常数值为1.62 s-1。该传感器对底物甲苯磺丁脲有很好的响应,在0-256.3μmol L-1范围内呈线性关系,表观米氏常数为186.37μmol L-1。另外,通过微分脉冲伏安法(DPV)测定抑制剂氟康唑和西咪替丁对该过程的半数抑制浓度(IC50)分别为4.2和17.6μmol L-1,为CYP2C9的中度抑制剂和弱抑制剂。
[Abstract]:Cytochrome P450 2C9 ( CYP450 ) is one of the most important enzymes involved in the metabolism of human liver microsomes . It has been found that CYP450 2C9 is one of the most important CYP450 isoforms ( about 20 % of total CYP proteins ) . In this paper , the inhibitory effect of five antidepressant drugs on p - toluenesulfonylurea was studied by means of cyclic voltammetry ( CV ) .

【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O657.1

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 高艾;王玉茹;何锡文;尹学博;;聚多巴胺包埋G-四联体/血红素DNA酶制备过氧化氢生物传感器[J];分析化学;2012年10期

2 王孟冬;韩逸陶;刘星星;聂舟;邓春艳;郭慢丽;姚守拙;;基于金纳米棒和超氧化物歧化酶层层自组装的超氧自由基生物传感器[J];中国科学:化学;2011年10期

3 徐欢;董斌;林月霞;田素娟;杜欣娥;;纳米胶体金的制备及粒径的测定[J];广东药学院学报;2010年02期

4 李俊华;许志锋;曾荣英;屈景年;陈晓东;;羧基化碳纳米管修饰碳糊电极伏安法测定痕量锌[J];冶金分析;2008年11期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 李聚仓;六种6，，7-呋喃香豆素对大鼠肝微粒体CYP2C9和2C19活性的影响[D];泰山医学院;2011年

本文编号：1895343