金属有机骨架与探针DNA构建的传感平台用于荧光检测核酸序列研究

发布时间：2018-07-13 08:30

【摘要】：微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源的、长度约为18～25nt的短链非编码RNA。miRNA具有基因调控作用,其表达水平异常往往与疾病的产生密切相关。因此,miRNA被视为一类新型的生物标记物。此外,病毒核酸非编码区域含有高度保守性的核酸序列,该保守核酸序列在病毒变异过程中能够保持不变。因此,无论是miRNA,还是病毒核酸保守序列,对其进行检测,在相关疾病的早期诊断和预测方面具有重要性意义。金属有机骨架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)是由无机金属离子和有机配体配位自组装构筑形成的新型无机有机杂化材料。2013年,Chen等首次报道具有良好水稳定性的MOFs可与荧光标记的探针DNA(probe DNA,P-DNA)结合构筑P-DNA@MOF传感平台,用于荧光检测核酸分子。但是,MOFs用十核酸分子检测仍处在起步阶段,只有为数不多的MOFs被成功用于检测DNA/RNA,主要是因为大多数合成的MOFs对水不稳定。因此,构建具有水稳定性的MOFs结构,并从中筛选出能够灵敏特异性检测疾病相关的核酸分子对疾病的检测具有重要的意义。近年来,本课题组一直致力于设计并合成结构新颖、且具有良好水稳定性的MOFs及其生物性能研究。含亚甲基的季铵盐型多羧酸配体与金属离子构筑的MOFs具有良好水稳定性,可避免其在核酸分子检测中结构坍塌而导致检测失败。本论文研究了该类MOFs与荧光标记的探针DNA构筑P-DNA@MOF传感平台及其对疾病相关的RNA序列检测的性能:一、应用三维 MOF {[Cu(Cmdcp)(phen)(H20)]2·9H2O}5(1)分别与 FAM 荧光标记的P-DNA-1和ROX荧光标记的P-DNA-2结合构筑P-DNA-1@1和P-DNA-2@1传感平台,并成功用于荧光检测EBOV的保守序列片段(T1)及该病毒编码的类miRNA(T2)。其中,MOF 1对P-DNA-1和P-DNA-2的淬灭率分别为75%和95%;对Ti和T2的检测时间分别为12.5 min和3.2min,检测限分别为63 pM和206 pM。为了克服操作繁琐、费时费力的缺点,进一步将P-DNA-1和P-DNA-2同时与MOF 1结合构筑P-DNAs@1传感平台,并结合恒波长同步荧光检测法同时对Ti和T2进行荧光检测。虽然MOF 1对T1和T2的同步检测与单独检测活性相当,但是同步检测可以简称检测过程,节约检测时间。二、MOFs与P-DNA主要通过π-π堆积、静电以及氢键等作用力结合,增加MOFs结构中的π体系有利于MOFs更有效的与P-DNA结合。因此,我们通过引入稠环配体bipy(bipy=4,4'-bipyridine)和具有更大稠环体系的季铵盐羧酸 Dcbb(Dcbb= 1-(3,5-dicarboxybenzyl)-4,4'-bipyridiniumbromide)共同构建了二维MOF[Cu(dcbb)(bipy)(H2O)]n(2),并将其用于同步荧光检测ZIKV非编码区的3段保守序列片段T3、T4和T5。研究表明,MOF2对分别为FAM、ROX和Cy5荧光标记的P-DNA-4、P-DNA-5和P-DNA-6均具有良好的荧光淬灭性能,荧光淬灭率分别为88%、96%和80%,并且所构筑的P-DNAs@2能够高灵敏、高选择性地同步荧光检测T3、T4和T5,检测时间分别为12 min、2.3 min和3 min,检测限分别为564 pM、158 pM和186 pM。三、为了考察P-DNA@MOF传感平台的实用价值,我们将检测对象由病毒核酸非编码区的保守序列转为疾病相关的且表达异常的miRNA。采用课题组前期合成的一维MOF {[Cu(Dcbb)2(H2O)2]·10H2O}n(3)构建传感平台,用于荧光检测与胃癌相关的5种miRNA。由于目前仍未寻找到适用于同步荧光检测的5 种荧光标记物,因此,我们对与 miR-185(T6)、miR-20a(T7)、miR-92b(T8)、miR-25(T9)以及miR-210(T10)互补的5种DNA均进行FAM荧光标记,并分别与MOF 3结合构筑P-DNA-6@3～P-DNA-10@3传感平台,淬灭率分别为87%、94%、77%、95%以及 96%。P-DNA-6@3～P-DNA-10@3 分别对 T6～T10 逐个进行荧光检测,检测时间分别为13 min、14 min、15 min、19 min以及38 min;检测限分别为172pM、321pM、91pM、559 pM以及132pM。本实验研究初步证明以MOFs构建的传感平台对多种miRNA检测的可行性。四、为了进一步研究MOFs构建的传感平台在细胞水平上对miRNA的检测性能,我们采用了对核酸酶稳定且对其靶向RNA的亲和力较普通核酸强的2'OMe-PSchimera(简称mDNA)来构建传感平台。我们采用FAM、TAMRA和Cy5分别对3种mDNA进行荧光标记得到P-mDNAs,并与三维的MOF{[Cu2(Cmdcp)2(bipy)(H2O)2]0.5H2O}n(4)同时结合构筑荧光传感平台P-mDNAs@4用于同步荧光检测与口腔癌相关的miR-21、miR-155和miR-375。其中MOF 4对P-m21、P-m155和P-m375的荧光淬灭率分别为89%、94%和87%;对T21、T155和T375的检测时间分别为5.3min、1.9min和1.5min;检测限分别为 229pM、64pM 和 385 pM。与 P-DNAs@4 传感平台(对 T21、T155 和 T375 的检测时间分别为13 min、3.4 min和2.6 min;检测限分别为750 pM、445 pM和629 pM)相比较,P-mDNAs@4对靶向miRNA的检测更为快速和灵敏。在此基础上,我们进一步将P-mDNA@4导入UM1、HSC3和SCC9这3种口腔癌细胞并成功地检测胞内高表达的miR-21、miR-155,而对低表达的miR-375没有显示检测效果。上述荧光检测中,MOF 1-4分别构筑的荧光传感平台均能快速、灵敏、高选择性地检测相应的靶向RNA。我们还进一步通过结合常数的计算、荧光各向异性实验和PAGE凝胶电泳实验初步阐述了 MOFs检测核酸分子的检测机理。
[Abstract]:In recent years , MOFs with good water stability have been successfully used to detect DNA / RNA . In recent years , MOFs with good water stability have been successfully used to detect DNA / RNA . In order to further study the feasibility of using MOFs to detect miRNA , the detection limits were respectively 172pM , 321pM , 91pM , 55pM and 132pM . The detection limits were respectively 172pM , 321pM , 91pM , 559 pM and 132pM . The detection limits were respectively : On this basis , we further introduced three kinds of oral cancer cells , such as UM1 , HSC3 and SCC9 , and successfully detected miR - 21 , miR - 155 with high expression of miR - 21 and miR - 155 .
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O657.3;R440

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