【摘要】：核酸是具有多种重要功能的生物大分子,长期以来作为分子生物学领域内热点研究对象。在上世纪80年代初,Cech和Altman等发现了具有催化活性的RNA分子,这些RNA分子被称为核酶(ribozyme,RNAzyme或RNA enzyme)。核酶的发现打破了“酶是蛋白质”的传统学术观念,直接推动了酶学与RNA功能研究的发展。在90年代中期,Breaker和Joyce首次通过体外筛选获得一种可以催化断裂RNA的单链DNA分子,这类具有催化活性的DNA分子被称为脱氧核酶(deoxyribozyme,DNAzyme或DNA enzyme)。脱氧核酶的发现,拓展了DNA的功能,丰富了酶的种类,是酶学研究中一次较为重要的突破。依据催化功能不同,脱氧核酶大体分为3种类型:断裂型、连接型以及其他类型,其中断裂型脱氧核酶数量最多。类手枪脱氧核酶(pistol-like DNAzyme)是该类型脱氧核酶的典型代表之一,具有氧化断裂DNA活性,由Breaker课题组于1998年通过体外筛选获得。本论文以类手枪脱氧核酶为研究对象,对其酶学性质、催化机制、结构与功能关系以及该脱氧核酶对铜离子检测应用等方面进行较为深入全面的研究与探索。首先,我们鉴定多种辅因子对类手枪脱氧核酶催化活性的影响并探讨其催化机制。在分析辅因子与类手枪脱氧核酶活性关系时,我们发现抗坏血酸单独存在时类手枪脱氧核酶就可以产生断裂反应,加入铜离子后,断裂程度增强。将谷胱甘肽加入到类手枪脱氧核酶/抗坏血酸反应系统中,期望维持还原态抗坏血酸水平以提高断裂效率,然而实验数据显示谷胱甘肽在类手枪脱氧核酶催化反应中发挥3种作用:单独存在时对类手枪脱氧核酶活性无作用,有效抑制抗坏血酸诱导的类手枪脱氧核酶催化反应以及大幅增强铜离子对类手枪脱氧核酶催化作用。我们以新发现辅因子抗坏血酸和谷胱甘肽为线索,对类手枪脱氧核酶辅因子种类进行扩展性研究,共鉴定4类(维生素类、巯基类、酚类和胺类)30种化合物对该脱氧核酶催化活性作用。在铜离子存在情况下,新确定辅因子还原性辅酶(II)、核黄素、黄素单核苷酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻苯三酚、间苯三酚、邻苯二胺、3,3',5,5'-四甲基联苯胺和羟胺。在无铜离子存在时,鉴定对苯二酚、邻苯三酚以及邻苯二胺有促进催化作用。我们又以邻苯二酚结构为参考,进一步发现多巴胺类化合物也可以做该脱氧核酶辅因子。上述研究表明类手枪脱氧核酶的辅因子种类广泛、结构多样,需从催化机制方面做出合理解释。抗坏血酸/二价铁离子和过氧化氢/二价铁离子是常用的羟自由基产生体系,二者对类手枪脱氧核酶无作用,表明该脱氧核酶氧化断裂反应与羟自由基不直接相关。在邻苯三酚、核黄素或次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系存在时,类手枪脱氧核酶发生断裂反应,而这三者可产生超氧阴离子和过氧化氢,提示脱氧核酶断裂与之密切相关。此外,过氧化氢酶抑制该脱氧核酶催化作用以及超氧化物歧化酶促进作用也提供了有效的辅助信息。综合有关实验现象和数据,我们提出类手枪脱氧核酶催化机制为超氧阴离子和过氧化氢介导的DNA氧化断裂反应。随后,我们对类手枪脱氧核酶结构与功能关系进行研究。对该脱氧核酶催化核心15个脱氧核苷酸进行饱和单点突变(56个突变体),在4组辅因子(抗坏血酸/铜离子、谷胱甘肽/铜离子、邻苯三酚/铜离子和羟胺/铜离子)条件下分别鉴定突变体活性变化,发现高度保守脱氧核苷酸A4和C5,其他13个脱氧核苷酸的保守性与辅因子种类有关,在谷胱甘肽/铜离子组,脱氧核苷酸保守性最弱,而在羟胺/铜离子组,保守性最强,表明在不同辅因子存在时,类手枪脱氧核酶脱氧核苷酸保守性具有漂移性,并发现突变体T8G存在单链构象多态性现象。对高活性突变体T3G做进一步酶学性质表征,发现在优化反应条件下,还原性辅酶(II)单独使用就可使类手枪脱氧核酶发生氧化断裂反应,为该脱氧核酶催化机制增添了更多的实验证据。最后,基于类手枪脱氧核酶断裂活性与谷胱甘肽/铜离子浓度关系以及该脱氧核酶二级结构特点,我们构建了一种荧光型铜离子传感器PL-Cu 1.0。该传感器对铜离子具有较高的灵敏度和专一性,检测下限为21.1 n M,铜离子浓度在80 n M-30μM内,荧光信号与浓度对数成线性关系,样品中其他金属离子(例如钙、镁离子)浓度是铜离子浓度1000倍时不干扰检测结果。我们利用该传感器对自来水和瓶装水进行了铜离子含量检测与分析。在PLCu 1.0传感器基础上,我们做了进一步改良优化,选用类手枪脱氧核酶高活性突变体T3G、强荧光分子Texas-Red以及价格低廉的巯基乙醇,设计了一种改进型铜离子传感器PL-Cu2.0。该传感器具有更高的检测灵敏度,检测下限可达3.2 n M,抗钙、镁等离子干扰浓度提升到10000倍,对铜制炊具内水中铜离子含量变化进行了较为精密的检测。该部分研究表明类手枪脱氧核酶作为一种生物材料适合构建DNA分子传感器,为相关脱氧核酶传感器研究奠定了扎实的理论与实践基础。在本论文中,我们发现了类手枪脱氧核酶多种类型辅因子,研究探讨了其催化机制,分析明确了催化核心内脱氧核苷酸与活性关系,并基于该脱氧核酶酶学性质和结构特点构建了2种荧光型铜离子传感器。这些研究丰富了脱氧核酶研究内容,拓展了脱氧核酶的应用范围,具有一定的酶学研究价值以及较佳的酶工程应用效益。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O629.8;O657.3
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本文编号：
2298160
