凝血酶联适配体法检测蛋白质

发布时间：2018-11-17 20:04

【摘要】：核酸适配体是一种能和靶分子特异性结合的人工体外合成的单链寡核苷酸,其靶分子可以是离子、小分子、蛋白质甚至整个细胞。近年来,适配体作为分子识别探针已经在医疗诊断、化学分析、环境检测、食品安全等方面发挥了重要作用。在基于适配体的分析研究中,凝血酶的两种适配体是短链,合成成本低,而且它们可与凝血酶的不同位点结合,形成三明治结构,同时不影响凝血酶的催化活性,因此凝血酶与其适配体是最常见的研究对象。但是这些研究大多数都集中在对凝血酶的检测上。利用适配体对凝血酶的亲和力以及凝血酶的催化活性等特点,本文发展了新型的凝血酶联适配体法(TLAA)检测其他蛋白质,拓展了凝血酶及其适配体的分析应用。构建了一条由蛋白质目标分子适配体序列和凝血酶的适配序列体组成的DNA探针,DNA探针既可与蛋白质目标分子结合,也可与凝血酶结合,通过凝血酶和适配体的直接结合将凝血酶分子标记在蛋白质上,从而将蛋白质的检测转化为凝血酶的检测。凝血酶催化底物产生光学信号,实现对蛋白质的定量测定。以血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)的检测为例,分别建立了几种不同模式的TLAA检测方法,包括三明治夹心模式的TLAA,滚环扩增偶联的TLAA和竞争模式的TLAA。整个论文包括如下6个章节:第一章:简要介绍了适配体的筛选和特点,综述了基于适配体的蛋白质检测方法,阐述了论文的立题背景、主要研究内容和创新点。第二章:发展了一种以磁球为基底的三明治模式TLAA检测蛋白质。DNA探针(由PDGF-BB的适配体、凝血酶的适配体和连接臂三部分组成)和包被在磁球上的抗体分别与PDGF-BB的两个位点结合,形成三明治结构,凝血酶与DNA探针中凝血酶适配体部分结合从而标记在三明治复合物上,凝血酶催化荧光底物或生色底物,产生可检测信号的产物,实现定量测定PDGF-BB。磁球的预富集作用和凝血酶的催化放大使该方法有较高的灵敏度,使用荧光底物时,检出限为16 pM。使用生色底物可以进行简单常见的吸光度分析,同时由于产物有颜色,可以利用反应前后溶液颜色的变化进行目测,实现对PDGF-BB的半定量检测。第三章:发展了一种以微孔板为基底的三明治模式TLAA检测蛋白质。在上一章工作的基础上,本论文以微孔板为固体基质,利用其快速高通量检测的优点,将抗体修饰在微孔板上,随后依次在微孔板中加入PDGF-BB和DNA探针,形成三明治结构。然后凝血酶被DNA探针捕获,标记在复合物上。凝血酶催化荧光多肽底物产生荧光信号,信号的强度与PDGF-BB的浓度在一定范围内呈线性相关。该方法也可用于复杂样品中PDGF-BB的检测。第四章:发展了滚环扩增偶联的凝血酶联适配体检测方法(RCA-coupled TLAA)。方法利用RCA反应产生具有重复凝血酶适配体序列的寡核苷酸,从而实现多重的凝血酶标记,而凝血酶的催化功能则将检测信号放大,实现了RCA和凝血酶催化的双重放大效应,进一步提高了检测灵敏度。修饰在微孔板上的抗体、PDGF-BB和连有引物的适配体形成三明治结构,引物与编码有凝血酶适配体互补序列的模板杂交,RCA反应将引物序列延伸,产生一条含有多重凝血酶适配体的长DNA链,RCA产物可以捕获许多凝血酶分子,在三明治复合物中实现多重的凝血酶标记。凝血酶催化其生色底物或荧光底物产生可检测的产物,实现对目标蛋白质的定量测定。由于RCA和凝血酶催化的双重放大效应,检测的灵敏度得到提高,在使用荧光底物的情况下,方法的检出限可低至3.1 pM,与单个凝血酶分子标记相比,检出限降低了62倍。第五章:构建了竞争模式的TLAA检测体系。首先PDGF-BB吸附在微孔板表面,然后溶液中的PDGF-BB和固定在微孔板上的PDGF-BB竞争性地与一条包含PDGF-BB适配体和凝血酶适配体的DNA探针结合,与固定的PDGF-BB结合的DNA探针捕获凝血酶分子,最后捕获的凝血酶催化底物产生荧光信号,进而完成对溶液中PDGF-BB的定量检测。溶液中的PDGF-BB越多,与固定的PDGF-BB结合的凝血酶就越少,从而引起荧光信号的下降。方法可以检测0.125 nM的PDGF-BB,同时实现在1%人血清的检测。与三明治检测模式相比,竞争模式的TLAA只需要一个亲和探针,缩短了实验时间。通过简单改变DNA探针中适配体序列,该方法可以凝血酶为标记用于其它物质的检测,扩大了检测物范围。第六章:总结了本文的主要工作和创新点,提出了下一步的工作计划。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446;O657.3

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 李一林;郭磊;张朝阳;唐吉军;谢剑炜;;适配体探针传感技术进展[J];中国科学(B辑:化学);2008年01期

2 王巍;贾凌云;;适配体筛选方法研究进展[J];分析化学;2009年03期

3 谢海燕;陈薛钗;邓玉林;;核酸适配体及其在化学领域的相关应用[J];化学进展;2007年06期

4 屈锋;刘允;任肖敏;赵新颖;张经华;;毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用[J];化学进展;2009年Z2期

5 赵强;乐晓春;;核酸适配体亲和色谱的研究进展[J];色谱;2009年05期

6 朱静;黄勇;蒋小平;谭钟扬;蒋健晖;沈国励;俞汝勤;;基于核酸适配体-质粒DNA复合物信号放大的荧光免疫传感技术[J];分析化学;2009年11期

7 ;生物分析中的核酸适配体[J];分析化学;2012年05期

8 李瑜;王源升;于斌;张静秋;董瑞;;核酸适配体在光生化检测中的应用[J];广州化工;2012年14期

9 王周平;张维潇;;适配体及其研究进展[J];食品与生物技术学报;2013年09期

10 ;《核酸适配体手册》[J];分析化学;2013年12期

相关会议论文 前10条

1 蔡圣;刘彩云;卢建忠;;基于核酸适配体和酶循环放大的腺苷化学发光检测[A];中国化学会第十届全国发光分析学术研讨会论文集[C];2011年

2 陈巍;赵新颖;屈锋;;毛细管电泳法筛选蛋白质的核酸适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会（2010景德镇）论文集[C];2010年

3 杨晓娟;邴涛;梅宏成;上官棣华;;核酸适配体用于手性拆分L型和D型色氨酸[A];全国生物医药色谱学术交流会（2010景德镇）论文集[C];2010年

4 郑冬梅;娄新徽;;一种基于结构开关型适配体的无标记荧光传感法[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

5 薛利云;周小明;邢达;;基于核酸适配体探针和酶辅助荧光信号扩增的等温高灵敏度蛋白检测方法[A];中国光学学会2011年学术大会摘要集[C];2011年

6 马文韬;古力;屈锋;;毛细管电泳筛选大肠杆菌适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会（2010景德镇）论文集[C];2010年

7 梁好均;徐华国;邓伟;;核酸适配体链构象转变的研究[A];2014年两岸三地高分子液晶态与超分子有序结构学术研讨会摘要集[C];2014年

8 王晓芳;程琳;耿霞;赵强;;基于适配体修饰的磁珠和量子点荧光法检测凝血酶[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

9 汪海林;章大鹏;;单核苷水平核酸适配体与蛋白质相互作用分析[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

10 温桂清;范燕燕;梁爱惠;蒋治良;;核酸适配体纳米金共振散射光谱检测血清中钾离子[A];中国化学会第十五届全国有机分析及生物分析学术研讨会论文集[C];2009年

相关重要报纸文章 前2条

1 潘文;核酸适配体在医药领域应用前景广阔[N];中国医药报;2010年

2 于洋　田野;蛋白质检测有了新方法[N];吉林日报;2011年

相关博士学位论文 前10条

1 郭丽敏;凝血酶联适配体法检测蛋白质[D];山西大学;2017年

2 黄玉坤;基于核酸适配体识别-时间分辨荧光纳米探针的生物毒素检测方法研究[D];江南大学;2015年

3 陈霞;功能核酸的筛选及在分析检测中的应用[D];武汉大学;2012年

4 林雪霞;微流控芯片与可控适配体技术用于细胞代谢物分析及其相互作用的研究[D];北京化工大学;2015年

5 周庆同;生物相空间中的适配体和药物虚拟筛选[D];中国科学技术大学;2015年

6 郭业民;基于适配体传感器的牛奶中抗生素残留快速检测技术研究[D];东北农业大学;2015年

7 李菁菁;适配体功能化的荧光纳米探针用于蛋白和细胞传感研究[D];南京大学;2012年

8 于鸽;乙丙肝病毒相互干扰及适配体在肝癌诊断及靶向治疗中的作用[D];吉林大学;2016年

9 王成全;基于磁控适配体传感体系的农产品中典型霉菌毒素检测研究[D];江苏大学;2016年

10 姜红岩;自组装RNA适配体纳米传感器[D];北京协和医学院;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 张月侠;蛋白质寡核苷酸适配体的筛选与应用研究[D];山东师范大学;2009年

2 李慧玲;BHL DNA适配体对铜绿假单胞菌群体感应系统抑制作用的研究[D];福建医科大学;2015年

3 刘金钏;适配体纳米金比色法灵敏度影响因素研究及其在食品安全检测中的应用[D];中国农业科学院;2015年

4 于连元;核酸适配体修饰的纳米颗粒在肿瘤靶向免疫治疗及靶向热疗中的应用[D];北京协和医学院;2015年

5 赵变军;基于适配体特异性作用的乳腺癌细胞表面多种肿瘤标记物同时检测的新方法研究[D];南京师范大学;2015年

6 乔醴峰;基于核酸适配体的β-葡萄糖醛酸苷酶一步纯化固定化研究及其应用[D];石河子大学;2015年

7 吕莉;基于适配体的酶联吸光度法检测血小板衍生生长因子-BB[D];山西大学;2015年

8 陈艳霞;核酸适配体/小檗碱荧光体系的构筑及分析应用[D];山西大学;2015年

9 吕琴;基于荧光标记适配体的荧光各向异性法检测小分子[D];山西大学;2015年

10 朱志玲;基于核酸适配体的赭曲霉毒素A SPR检测技术研究[D];北京化工大学;2015年

，

本文编号：2338898