中国对虾蛋白致敏小鼠模型构建及主要过敏原的双向电泳联合质谱鉴定
发布时间：2019-08-08 17:49
【摘要】：目的:构建中国对虾蛋白致敏小鼠模型并研究关键过敏原。方法:采用液氮研磨结合裂解液裂解对虾肌肉提取蛋白浸出液,用不同剂量的中国对虾蛋白和弗氏佐剂的混合液腹腔注射诱发ICR小鼠致敏,采用间接ELISA方法检测小鼠血清中过敏原特异性IgE和IgG1水平在激发期不同时间点的变化,并观察致敏小鼠行为评分,建立动物致敏模型;利用双向电泳分离虾蛋白,并与阳性血清免疫印迹,从而通过质谱分析其主要过敏原。结果:3组不同剂量的虾蛋白浸出液都能使小鼠出现不同程度的过敏症状,且剂量越高过敏反应越显著;其中,高剂量组(1.0 mg)小鼠血清特异性IgE和IgG1抗体含量显著升高(P0.05),出现瘙痒、嘴角红肿等现象,过敏症状最显著。通过双向电泳联合质谱鉴定发现,能与阳性血清反应的蛋白有两种,一种蛋白分子质量为40.2ku,等电点分别为6.0和6.2,经比对为精氨酸激酶;另一种蛋白分子质量为35.8 ku,其等电点为4.6,经比对为原肌球蛋白,通过Mascot数据库分析比较得到这两种蛋白质的氨基酸序列。结论:中国对虾蛋白可引起小鼠过敏反应,其主要过敏原为原肌球蛋白和精氨酸激酶,其中精氨酸激酶可能存在不同蛋白质修饰的两种形式。
【图文】：
中国食品学报2017年第12期0.60.50.40.30.2吸光值/OD595nmy=0.5389x+0.2866R2=0.996400.10.20.30.40.5蛋白质量浓度/μg·μL-1图1中国对虾蛋白浸出液含量的标准曲线Fig.1Thestandardcurveofshrimpproteinconcentration电泳等多个步骤，之后经过考马斯亮蓝R250染色，用超纯水脱色至蛋白点清晰可见，后在成像系统中拍照，通过双向电泳分析软件进行蛋白点分析。1.2.6免疫印迹鉴定中国对虾主要过敏原待双向电泳结束后，二向胶直接进行Westernblotting。先将与胶等大的PVDF膜浸入100%甲醇中15s，取出膜将凝胶、滤纸一起浸入转膜缓冲液中平衡10min。在半干式电转移仪上按照从正极到负极的顺序依次放置2层滤纸、PVDF膜、凝胶、2层滤纸，每层均精确对齐并排除气泡，按15V恒压转移2h，电转移结束后，取出PVDF膜，用PBS-T洗液洗涤数次，加入5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，弃封闭液，用PBS-T洗液洗涤数次，加入适度浓度稀释的过敏小鼠血清一抗，对照组加入过敏前小鼠血清，4℃下孵育过夜，用PBS-T洗液洗涤数次，加入适度浓度稀释的HRP标记大鼠抗小鼠IgE二抗，在室温下孵育2h，用PBS-T洗液洗涤数次，最后在暗室中将ECL发光A液、B液加到PVDF膜上，进行压片、显影、定影，最后在暗格中检测信号并拍照保存。1.2.7中国对虾过敏原蛋白质组学研究1.2.7.1酶解主要参考Addis等[6-7]的处理方法进行修改，将差异蛋白点从凝胶上挖出，放入处理过的1.5mLEP管中，用超纯水反复冲洗后，进行差异蛋白点胶内酶切。主要步骤为（1）脱色：加入50μL脱色液进行脱色，使蛋白质点由深褐色变成无色透明。用100mmol/L碳酸氢铵冲洗凝胶后，用50%乙腈脱水使其变为白色，冷冻干燥；（2）酶解：蛋白点溶于50mmol/LNH4HC
第17卷第12期低剂量组对照组543210行为打分71421283542时间/d高剂量组对照组543210行为打分71421283542中剂量组对照组543210行为打分71421283542543210行为打分对照组低剂量组中剂量组高剂量组组别（a）低剂量组（b）中剂量组（c）高剂量组（d）3个剂量组比较图3中国对虾蛋白不同剂量组不同激发期小鼠行为打分Fig.3Thesymptomscoreofsensitizedmiceindifferenttimeperiods注：M：标准分子质量；1：虾肌肉蛋白样品。图2中国对虾肌肉蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2SDS-PAGEanalysisofshrimpmuscleprotein高的蛋白主要位于32~42ku，约占总蛋白的35%，而中国对虾的主要过敏原的分子质量也集中在这一范围，所以通过此裂解液得到的虾蛋白浸出液效果较好，为后续ICR小鼠致敏实验及过敏原鉴定奠定了基矗2.3ICR小鼠致敏模型的建立用提取的虾蛋白浸出液免疫小鼠使小鼠致敏，经过一个多月饲养后取血处死，在每个时间段进行小鼠过敏行为打分，结果见图3。处死后得到的血清通过间接ELISA法测定血清中的IgE和IgG1水平，以不同时期为横坐标，以在490nm和450nm波长下分别测得的吸光值为纵坐标，得到图4和图5。在行为打分和IgE、IgG1的表中得到，随着时间的延长，小鼠行为分数越来越高，说明小鼠致敏效果明显，且IgE和IgG1水平也逐步呈上升趋势。由图3~图5可见，3种剂量组的致敏效果明显都比对照组高（P＜0.05），，且随着剂量的增加，行为分数和IgE、IgG1的水平也越来越高。结果表明，3组不同剂量的虾蛋白浸出液都能使小鼠致敏，且剂量越高小鼠过敏反应越显著。时间/d中国对虾蛋白致敏小鼠模型构建及主要过敏原的双向电泳联合质谱鉴定时间/
【作者单位】： 浙江工商大学食品与生物工程学院浙江省食品安全重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金项目(31571770) 浙江省自然科学基金项目(LY14C200001)
【分类号】：O657.63;TS201.6
本文编号：2524508
【图文】：
中国食品学报2017年第12期0.60.50.40.30.2吸光值/OD595nmy=0.5389x+0.2866R2=0.996400.10.20.30.40.5蛋白质量浓度/μg·μL-1图1中国对虾蛋白浸出液含量的标准曲线Fig.1Thestandardcurveofshrimpproteinconcentration电泳等多个步骤，之后经过考马斯亮蓝R250染色，用超纯水脱色至蛋白点清晰可见，后在成像系统中拍照，通过双向电泳分析软件进行蛋白点分析。1.2.6免疫印迹鉴定中国对虾主要过敏原待双向电泳结束后，二向胶直接进行Westernblotting。先将与胶等大的PVDF膜浸入100%甲醇中15s，取出膜将凝胶、滤纸一起浸入转膜缓冲液中平衡10min。在半干式电转移仪上按照从正极到负极的顺序依次放置2层滤纸、PVDF膜、凝胶、2层滤纸，每层均精确对齐并排除气泡，按15V恒压转移2h，电转移结束后，取出PVDF膜，用PBS-T洗液洗涤数次，加入5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，弃封闭液，用PBS-T洗液洗涤数次，加入适度浓度稀释的过敏小鼠血清一抗，对照组加入过敏前小鼠血清，4℃下孵育过夜，用PBS-T洗液洗涤数次，加入适度浓度稀释的HRP标记大鼠抗小鼠IgE二抗，在室温下孵育2h，用PBS-T洗液洗涤数次，最后在暗室中将ECL发光A液、B液加到PVDF膜上，进行压片、显影、定影，最后在暗格中检测信号并拍照保存。1.2.7中国对虾过敏原蛋白质组学研究1.2.7.1酶解主要参考Addis等[6-7]的处理方法进行修改，将差异蛋白点从凝胶上挖出，放入处理过的1.5mLEP管中，用超纯水反复冲洗后，进行差异蛋白点胶内酶切。主要步骤为（1）脱色：加入50μL脱色液进行脱色，使蛋白质点由深褐色变成无色透明。用100mmol/L碳酸氢铵冲洗凝胶后，用50%乙腈脱水使其变为白色，冷冻干燥；（2）酶解：蛋白点溶于50mmol/LNH4HC
第17卷第12期低剂量组对照组543210行为打分71421283542时间/d高剂量组对照组543210行为打分71421283542中剂量组对照组543210行为打分71421283542543210行为打分对照组低剂量组中剂量组高剂量组组别（a）低剂量组（b）中剂量组（c）高剂量组（d）3个剂量组比较图3中国对虾蛋白不同剂量组不同激发期小鼠行为打分Fig.3Thesymptomscoreofsensitizedmiceindifferenttimeperiods注：M：标准分子质量；1：虾肌肉蛋白样品。图2中国对虾肌肉蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2SDS-PAGEanalysisofshrimpmuscleprotein高的蛋白主要位于32~42ku，约占总蛋白的35%，而中国对虾的主要过敏原的分子质量也集中在这一范围，所以通过此裂解液得到的虾蛋白浸出液效果较好，为后续ICR小鼠致敏实验及过敏原鉴定奠定了基矗2.3ICR小鼠致敏模型的建立用提取的虾蛋白浸出液免疫小鼠使小鼠致敏，经过一个多月饲养后取血处死，在每个时间段进行小鼠过敏行为打分，结果见图3。处死后得到的血清通过间接ELISA法测定血清中的IgE和IgG1水平，以不同时期为横坐标，以在490nm和450nm波长下分别测得的吸光值为纵坐标，得到图4和图5。在行为打分和IgE、IgG1的表中得到，随着时间的延长，小鼠行为分数越来越高，说明小鼠致敏效果明显，且IgE和IgG1水平也逐步呈上升趋势。由图3~图5可见，3种剂量组的致敏效果明显都比对照组高（P＜0.05），，且随着剂量的增加，行为分数和IgE、IgG1的水平也越来越高。结果表明，3组不同剂量的虾蛋白浸出液都能使小鼠致敏，且剂量越高小鼠过敏反应越显著。时间/d中国对虾蛋白致敏小鼠模型构建及主要过敏原的双向电泳联合质谱鉴定时间/
【作者单位】： 浙江工商大学食品与生物工程学院浙江省食品安全重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金项目(31571770) 浙江省自然科学基金项目(LY14C200001)
【分类号】：O657.63;TS201.6
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本文编号：2524508
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/huaxue/2524508.html
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