可固定性荧光探针:线粒体成像的可靠工具
发布时间：2019-08-13 18:39
【摘要】：线粒体是一种具有双层膜结构的细胞器,参与细胞新陈代谢过程的能量循环以及离子平衡过程,在细胞生理过程中具有极其重要的意义。一些小分子荧光染料/探针结构中带有正电荷,因受到线粒体内膜负电势的牵引而标记在线粒体上,为研究线粒体的形态或功能提供了重要的可视化成像工具。然而,大多数线粒体染料/探针对线粒体的靶向标记稳定性仍不够理想,因为线粒体电势处于不断的动态变化中,当电势降低时,对染料的亲和力相应降低。尤其在病理条件下(比如细胞凋亡)细胞代谢受到阻滞时,线粒体膜电势显著降低,阳离子染料将扩散离开线粒体,造成非特异性荧光。最近,Kim团队和本人课题组提出可固定线粒体探针的新概念,用活性基团将荧光分子探针通过共价键固定在线粒体中,开发了稳定靶向线粒体中的定量探测微环境p H值、粘度、膜电势荧光探针。我们认为,对于追踪和探测具有高度动态变化特性的线粒体而言,开发可固定的线粒体荧光分子探针是必然趋势,因此本文进行评述和展望。
【图文】：
噬过程中均伴随着pH变化。研究线粒体pH变化的常规方法是通过现有的细胞质pH荧光探针对固定后的线粒体进行研究，这一方法并不能真实地展现线粒体发生病理变化时的pH变化［42］。生物学的方法是通过基因编辑技术将pH敏感的绿色荧光蛋白表达在线粒体中，该方法能够实时展示线粒体的pH变化，但是该方法步骤繁琐并不能像小分子荧光探针那样快速简易地展示线粒体pH变化［43］。Kim等［44］首次设计了能够固定于线粒体中的pH敏感型荧光探针1。该荧光探针通过季擕盐对线粒体进行标记并通过苄氯基团使其固定在线粒体中。图1探针1的化学结构及线粒体pH检测机理［44］Fig．1Structureofprobe1andproposedmitochondrion-specificpHsensingmechanismforprobe1［44］探针分子1通过分子内PET效应来控制其发光性能，对环境中的pH变化较为敏感，在pH值为2～11内具有很好的荧光强度变化。探针分子1对线粒体染色后通过CCCP(羰基氰化氯萃腙)刺激来降低线粒体膜电位，荧光成像照片显示，线粒体膜电位降低后该分子仍能很好地标记在线粒体内。该研究通过对外源性pH进行调整并以MTＲ(MitoTrackerＲed，商业化线粒体固定染料)为内标绘制了不同pH下比率值的标准曲线，并通过比率成像技术实现了对正常细胞和饥饿细胞的线粒体内pH值的测定。同时，细胞饥饿处理会引发细胞自噬过程进而导致细胞凋亡，该研究通过对线粒体和溶酶体进行荧光标记实时监测了细胞饥饿引发自噬过程中的pH变化。通过固定于线粒体的pH探针对线粒体内的pH变化进行研究，打破了常规的研究方法，能够实时地区分正常和病态的线粒体，为研究线粒体生理过程及药物设计提供了很好的工具和启示。3．2可固定线粒体膜电位探针线粒体中pH变化究其本源终究是线粒体膜电位的变化。对线粒体膜电位变化进行探
图2探针分子1和MTＲ对HeLa细胞的线粒体pH的检测成像［44］Fig．2MitochondrialpHdeterminationinHeLacellsusingprobe1andMitoTrackerＲed［44］(a)Confocalmicroscopyimagesof1(5.0μmol/L)andMitoTrackerＲed(MTＲ)(0.1μmol/L)infixedcellsexposedtoexternalmediafixedatpH5，6，，7，and8，respectively．(b)IntracellularpHcalibrationcurveconstructedbyplottingIgreen/IredvspH．Thedotsarebasedontheaveragewiththeindicatedstandarderror．ThetableprovidestheaveragepHvaluesofthemitochondriainintactandnutrient-deprivedcells．(c)Imagesof1andMTＲinintactcells图3MITFPS的化学结构及工作机理［45］Fig．3StructureandworkingprincipleofbipolarandfixableMITFPS［45］线粒体中不同位置的膜电位变化，还可以通过CCCP刺激细胞时线粒体膜电位丧失，实时动态地检测线粒体在去极化过程中的膜电位变化。如图4所示，随着CCCP刺激的时间延长，探针分子的荧光寿命逐渐增强，通过对不同区域的荧光寿命进行监测发现，探针分子在线粒体去极化过程中荧光寿命平均增加约20%，实现了对线粒体内膜去极化过程的实时监测。这一研究通过将具有固定结构的极性敏感荧光探针引入并固定在线粒体中，能够更为精准地展示线粒体膜电位的变化，同时为研究线粒体病理过程提供了优良的工具。3．3可固定线粒体粘度探针线粒体的微环境不仅仅局限于pH和膜电位，线粒体基质不同状态下的粘度同样对线粒体的生理过程有着极其重要的影响。线粒体基质粘度变化对线粒体形貌、代谢产物扩散等过程有着重要影响，与众多疾病和细胞病变息息相关。有关线粒体粘度变化的文献鲜有报道。我们团队首次设计合成了能够固定在线粒体中的粘度探针Vis-A和对比探针分子Vis-B［45］。Vi
【作者单位】： 大连理工大学精细化工国家重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金(21174022,21376038,21421005,21576040) 国家重大基础研究专项基金(2013CB733702)资助~~
【分类号】：O657.3;Q244
本文编号：2526291
【图文】：
噬过程中均伴随着pH变化。研究线粒体pH变化的常规方法是通过现有的细胞质pH荧光探针对固定后的线粒体进行研究，这一方法并不能真实地展现线粒体发生病理变化时的pH变化［42］。生物学的方法是通过基因编辑技术将pH敏感的绿色荧光蛋白表达在线粒体中，该方法能够实时展示线粒体的pH变化，但是该方法步骤繁琐并不能像小分子荧光探针那样快速简易地展示线粒体pH变化［43］。Kim等［44］首次设计了能够固定于线粒体中的pH敏感型荧光探针1。该荧光探针通过季擕盐对线粒体进行标记并通过苄氯基团使其固定在线粒体中。图1探针1的化学结构及线粒体pH检测机理［44］Fig．1Structureofprobe1andproposedmitochondrion-specificpHsensingmechanismforprobe1［44］探针分子1通过分子内PET效应来控制其发光性能，对环境中的pH变化较为敏感，在pH值为2～11内具有很好的荧光强度变化。探针分子1对线粒体染色后通过CCCP(羰基氰化氯萃腙)刺激来降低线粒体膜电位，荧光成像照片显示，线粒体膜电位降低后该分子仍能很好地标记在线粒体内。该研究通过对外源性pH进行调整并以MTＲ(MitoTrackerＲed，商业化线粒体固定染料)为内标绘制了不同pH下比率值的标准曲线，并通过比率成像技术实现了对正常细胞和饥饿细胞的线粒体内pH值的测定。同时，细胞饥饿处理会引发细胞自噬过程进而导致细胞凋亡，该研究通过对线粒体和溶酶体进行荧光标记实时监测了细胞饥饿引发自噬过程中的pH变化。通过固定于线粒体的pH探针对线粒体内的pH变化进行研究，打破了常规的研究方法，能够实时地区分正常和病态的线粒体，为研究线粒体生理过程及药物设计提供了很好的工具和启示。3．2可固定线粒体膜电位探针线粒体中pH变化究其本源终究是线粒体膜电位的变化。对线粒体膜电位变化进行探
图2探针分子1和MTＲ对HeLa细胞的线粒体pH的检测成像［44］Fig．2MitochondrialpHdeterminationinHeLacellsusingprobe1andMitoTrackerＲed［44］(a)Confocalmicroscopyimagesof1(5.0μmol/L)andMitoTrackerＲed(MTＲ)(0.1μmol/L)infixedcellsexposedtoexternalmediafixedatpH5，6，，7，and8，respectively．(b)IntracellularpHcalibrationcurveconstructedbyplottingIgreen/IredvspH．Thedotsarebasedontheaveragewiththeindicatedstandarderror．ThetableprovidestheaveragepHvaluesofthemitochondriainintactandnutrient-deprivedcells．(c)Imagesof1andMTＲinintactcells图3MITFPS的化学结构及工作机理［45］Fig．3StructureandworkingprincipleofbipolarandfixableMITFPS［45］线粒体中不同位置的膜电位变化，还可以通过CCCP刺激细胞时线粒体膜电位丧失，实时动态地检测线粒体在去极化过程中的膜电位变化。如图4所示，随着CCCP刺激的时间延长，探针分子的荧光寿命逐渐增强，通过对不同区域的荧光寿命进行监测发现，探针分子在线粒体去极化过程中荧光寿命平均增加约20%，实现了对线粒体内膜去极化过程的实时监测。这一研究通过将具有固定结构的极性敏感荧光探针引入并固定在线粒体中，能够更为精准地展示线粒体膜电位的变化，同时为研究线粒体病理过程提供了优良的工具。3．3可固定线粒体粘度探针线粒体的微环境不仅仅局限于pH和膜电位，线粒体基质不同状态下的粘度同样对线粒体的生理过程有着极其重要的影响。线粒体基质粘度变化对线粒体形貌、代谢产物扩散等过程有着重要影响，与众多疾病和细胞病变息息相关。有关线粒体粘度变化的文献鲜有报道。我们团队首次设计合成了能够固定在线粒体中的粘度探针Vis-A和对比探针分子Vis-B［45］。Vi
【作者单位】： 大连理工大学精细化工国家重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金(21174022,21376038,21421005,21576040) 国家重大基础研究专项基金(2013CB733702)资助~~
【分类号】：O657.3;Q244
本文编号：2526291
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