黑曲霉N5-5单宁酶的纯化及酶学性质测定
【图文】：
Ｊ烞m和最大反应速率vmax。Lineweaver-Burk方程如式（2）所示：1v＝Kmvmax1[S]1vmax（2）2结果与分析2.1SDS-PAGE分析将凝胶层析收集到的30管洗脱样分别测定单宁酶活力（此处仅作比较，故以吸光度A270nm代表酶活力），将A270nm大于0.05的12～23号管蛋白作非还原SDS-PAGE，发现17号管蛋白电泳后的凝胶中仅有一条蛋白条带，因此可确定该蛋白条带为黑曲霉N5-5单宁酶。170kD130kD100kD70kD55kD45kD35kD25kD15kD1Marker21.还原SDS-PAGE；2.非还原SDS-PAGE。图1纯酶SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofpurifiedtannase由图1可知，非还原电泳和还原电泳结果均显示一条蛋白条带，表明黑曲霉N5-5单宁酶是由一条肽链形成的三级结构蛋白，根据蛋白质分子质量标准曲线，可计算其分子质量为64.2kD，这与喻晓蔚[25]报道的黑曲霉单宁酶分子质量较接近（63kD）。表1黑曲霉N5-5单宁酶纯化效果Table1SummaryofthepurificationstepsoftannasefromAspergillusnigerN5-5单宁酶总体积/mL总酶活力/U酶活力/（U/mL）蛋白质量浓度/（μg/mL）比活力/（U/μg）酶活力收率/%纯化倍数粗酶1850871997471.35574.820.82100.001.00超滤酶463455879984.62213.124.6252.285.64纯酶1252031721625.3899.3516.3623.3019.95由表1可知，黑曲霉N5-5单宁酶经纯化后，活力大大提升，相比粗酶可纯化近20倍，酶活力可回收23.30%。虽然“超滤＋层析”法相比传统方法并无纯化倍数优势（如Mahendran等[16]采用传统方法可使一种拟青霉单宁酶纯化倍数达到30.5），但该法工艺周期相比传统方法可缩短50%以上，，且获得的纯酶经电泳分析（图1）未见杂蛋白条带，可见纯化效果良好。
Ｊ烞m和最大反应速率vmax。Lineweaver-Burk方程如式（2）所示：1v＝Kmvmax1[S]1vmax（2）2结果与分析2.1SDS-PAGE分析将凝胶层析收集到的30管洗脱样分别测定单宁酶活力（此处仅作比较，故以吸光度A270nm代表酶活力），将A270nm大于0.05的12～23号管蛋白作非还原SDS-PAGE，发现17号管蛋白电泳后的凝胶中仅有一条蛋白条带，因此可确定该蛋白条带为黑曲霉N5-5单宁酶。170kD130kD100kD70kD55kD45kD35kD25kD15kD1Marker21.还原SDS-PAGE；2.非还原SDS-PAGE。图1纯酶SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofpurifiedtannase由图1可知，非还原电泳和还原电泳结果均显示一条蛋白条带，表明黑曲霉N5-5单宁酶是由一条肽链形成的三级结构蛋白，根据蛋白质分子质量标准曲线，可计算其分子质量为64.2kD，这与喻晓蔚[25]报道的黑曲霉单宁酶分子质量较接近（63kD）。表1黑曲霉N5-5单宁酶纯化效果Table1SummaryofthepurificationstepsoftannasefromAspergillusnigerN5-5单宁酶总体积/mL总酶活力/U酶活力/（U/mL）蛋白质量浓度/（μg/mL）比活力/（U/μg）酶活力收率/%纯化倍数粗酶1850871997471.35574.820.82100.001.00超滤酶463455879984.62213.124.6252.285.64纯酶1252031721625.3899.3516.3623.3019.95由表1可知，黑曲霉N5-5单宁酶经纯化后，活力大大提升，相比粗酶可纯化近20倍，酶活力可回收23.30%。虽然“超滤＋层析”法相比传统方法并无纯化倍数优势（如Mahendran等[16]采用传统方法可使一种拟青霉单宁酶纯化倍数达到30.5），但该法工艺周期相比传统方法可缩短50%以上，且获得的纯酶经电泳分析（图1）未见杂蛋白条带，可见纯化效果良好。
【作者单位】： 肇庆学院化学化工学院;华南农业大学食品学院;
【基金】：广东高校国际科技合作创新平台项目(2013gjhz0003)
【分类号】：O629.8
【参考文献】
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【共引文献】
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【二级参考文献】
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本文编号：2552594
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