酮不对称还原胺化菌株的分离鉴定及其催化性能研究

发布时间：2020-04-03 07:20

【摘要】：光学纯手性胺是一类具有重要应用价值的化合物,经常作为拆分剂和手性砌块被广泛用于医药、农业化学、精细化学等领域中。手性胺的合成方法包括化学法和生物法,相对于化学法,生物法因具有原子利用率高、选择性高、副产物少、催化过程条件温和、绿色环保等优点,而被越来越多的用于手性胺的合成制备。其中,最近发展的胺脱氢酶催化酮不对称还原胺化制备手性胺引起了学术界和工业界科研人员的广泛关注,因为该反应利用廉价的无机铵为胺供体,产生的副产物只有水,是一种更加绿色的手性胺制备过程。但是目前这类酶主要是以天然的L-氨基酸脱氢酶为起始对象,利用蛋白质工程技术改造而来,因此所获得的胺脱氢酶均为(R)-构型的酶,只能用来合成(R)-手性胺,迄今还未见有(S)-胺脱氢酶被报道。因此,本文主要目的是尝试通过土壤筛选从自然环境中获得具有酮不对称还原胺化合成(S)-手性胺功能的微生物,为天然来源(S)-胺脱氢酶的鉴定提供研究基础。首先,本文以(S)-α-苯乙胺为唯一氮源对土壤中的微生物进行分离筛选,得到了 2株具有酮不对称还原胺化能力的菌株;以(4-氟苯基)丙酮作为复筛底物,对这两株菌催化酮不对称还原胺化的能力进行了考察。结果显示菌株ES11在NH4C1的反应体系中可以高效转化(4-氟苯基)丙酮为(S)4-氟-α-甲基苯乙胺,产物ee99%,因此被确定为本文的研究对象。通过形态学特征分析和16S rDNA的鉴定,确定该菌株为表皮短杆菌,命名为 Brevibacterium epidermidis ECU1015。其次,对B.epidermidis ECU1015的催化性能进行研究,结果表明:该菌株催化还原胺化(4-氟苯基)丙酮反应的最佳胺供体为NH4Cl,最佳浓度为1.25 M,最适反应温度为30℃,最佳缓冲体系为KPB缓冲溶液(pH7.5,0.2M),最佳的助溶剂为DMSO;对于相应的脱氨化反应,最适反应温度为30℃,最佳缓冲体系为Glycine/NaOH缓冲溶液(pH 10.5,0.2 M)。此外,高底物浓度不利于该菌株催化还原胺化反应和脱氨化反应。最后,在最适的反应条件下,将B.epidermidis ECU1015催化的外消旋4-氟-α-甲基苯乙胺动力学拆分和(4-氟苯基)丙酮不对称还原胺化反应放大到100 mL反应规模,分别得到了(R)-和(S)-4-氟-α-甲基苯乙胺,ee均大于99%。这说明B.epidermidis ECU1015是一株具有酮不对称还原胺化功能的微生物,为(S)-胺脱氢酶的获取提供了研究对象。
【图文】：

不对称还原反应,亚胺

要的合成中间体。２００９年，罗格斯大学的Ｚｈａｎｇ课题组开发了一种新的催化反应路径，逡逑借助于过渡金属Ｒｈ实现了尽乙酰基酰胺到手性胺类化合物（ｅｅ邋＞９９．７％）的不对称还原合逡逑成（图１．４）问。逡逑２００８年，英国利物浦大学的Ｘｉａｏ和他的同事发现了一种新的Ｒｈ／二元胺催化剂，逡逑可以实现亚胺的不对称还原反应［１４］。另外，基于对催化剂的稳定性和操作的简易性考虑，，逡逑多个研发团队利用稳定的有机氢供体替代传统的氢供体成功地开发了新的催化反应体逡逑系。该不对称还原反应既可以在传统的催化反应体系（二氨基配体和Ｒｕ催化剂）中进行［１５］，逡逑也可以在有机相［１６］或水相［１７１中进行（图１．５）。逡逑［ＲｕＬｊ逦0逡逑、0人人＾邋ｈｃ0２ｈ＇（0２Ｈ５＂３ｎ、。人入广逡逑ｙｉｅｌｄ：邋８６％逡逑ｅｅ：邋９７％逡逑图１．５邋Ｒｕ催化的亚胺不对称还原反应逡逑Ｆｉｇ．邋１．５邋Ｒｕ－ｃａｔａｌｙｓｅｄ邋ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ邋ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｍｉｎｅ邋ｔｏ邋（５）－ｓａｌｓｏｌｉｄｉｎｅ．逡逑１．３．１．４酮还原胺化法逡逑0逦Ｎ邋八Ｐｈ逡逑ｎ邋ＴｉＣＩ４

单胺氧化酶,历程

逦ｏ２逡逑Ｒ１２＝Ｈ，ａｌｋｙｌ，ａｒｙｌ逡逑图１．１９胺氧化酶催化的氧化去胺化路径逡逑Ｆｉｇ．邋１．１９邋Ｇｅｎｅｒａｌ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｓｃｈｅｍｅ邋ｆｏｒ邋ｏｘｉｄａｔｉｖｅ邋ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｕｓｉｎｇ邋ａｍｉｎｅ邋ｏｘｉｄａｓｅ．逡逑胺氧化酶是氧化还原酶家族中的一员（ＥＣ邋１．４．３．４）。该家族酶能够催化氧化还原反应，逡逑尤其是单胺氧化酶能够实现手性胺到酮的氧化过程，当底物为伯胺时，可以实现伯胺到逡逑醛的转化，并伴随着氧气到过氧化氢的还原过程［３４］，如图１．１９所示。逡逑最近，Ｔｕｒｎｅｒ课题组对中的单胺氧化酶进行一系列改造，其突变逡逑体呈现出更广的底物谱，并且具有非常高的催化活性和对映选择性［３５］。在接下来的研究逡逑中，多个课题组以来自的单胺氧化酶突变体作为母本，针对不同的胺逡逑类化合物，进行了一系列的半理性和理性设计，获取适应各个催化反应的突变体［３６＿４３］，逡逑如图１．２０所示。逡逑个逡逑Ｉ逦８逦ｍ逡逑0邋ｈ邋逦逡逑Ｓ逦＿逦Ｄ５逡逑Ｓ－逦Ｄ８逦Ｆ２１０Ｌ逡逑0）逦Ｑ邋＇逦逦：－：逦Ｌ２１３Ｔ逡逑名逦Ｄ７逦Ｍ２４２Ｑ逡逑ｌ逦丨逦逦逦邋Ｍ２４６Ｔ逡逑ｉ逦ＡＸ逦Ｗ逦．逦５Ｔ＂１逦Ｗ４３０Ｈ逡逑ＣＯ逦ＮＨ
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O621.251;TQ460.1;Q93

【参考文献】