基于金纳米粒子的无酶扩增反应结合化学发光检测microRNA

发布时间：2020-04-08 00:15

【摘要】：MicroRNAs(mi RNAs)作为一种新的生物标志物,不仅参与生物体内的基因调控,还与癌症等重大疾病的产生密切相关。因此,探索发展准确的检测miRNA的方法备受关注。本论文研究内容中,我们将催化发夹DNA组装(CHA)和杂交链式反应(HCR)两种恒温无酶扩增技术和化学发光检测相结合,建立了检测miRNA的新方法。主要研究内容如下:一、结合金纳米粒子(AuNPs)的CHA与鲁米诺化学发光体系,建立了一种检测miRNA的新方法。首先,我们设计了巯基(-SH)修饰的P1和生物素(biotin)修饰的P2(bio-P2)两种发夹DNA探针。然后,将探针P1修饰在AuNPs表面。当目标miRNA存在时,其与探针P1的部分序列互补杂交,将P1发夹结构打开,形成P1-miRNA中间体。该中间体可引发bio-P2发夹结构展开,形成P1-P2双链DNA。同时,目标miRNA被顶替下来。随后,miRNA又可与AuNPs表面其余的P1探针作用,进而与P2探针形成P1-P2双链,如此循环,发生CHA反应。实现了bio-P2探针在金纳米粒子表面的富集。再通过链霉亲和素(STV)与biotin的特异性作用,将辣根过氧化物酶(HRP)标记的STV(STV-HRP)结合在AuNPs表面,经过离心分离,利用HRP催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反应,实现了miRNA的检测。方法中,miRNA的线性范围为5 pM-100pM,检出限为1.7 pM。该方法操作简便,成本低,可为基于CHA反应的miRNA检测提供一种新策略。二、将HCR和化学发光检测相结合,以AuNPs为载体,发展了灵敏检测miRNA的新方法。实验设计了三种发夹探针:H1,H2,H3。其中,发夹探针H1以-SH修饰,H2以botin修饰。探针H1通过Au-S键结合到AuNPs表面。当反应体系中含有目标miRNA时,其可与发夹探针H1作用,使其结构打开,并释放出HCR的引发序列。随后,该引发序列引发探针H2和H3之间发生一系列的HCR。再基于STV和biotin之间的特异性相互作用,将STV-HRP结合到HCR产物上,应用HRP-鲁米诺-过氧化氢化学发光体系,通过检测化学发光信号强度的变化实现对miRNA的检测。方法可对浓度范围在5 pM-100 pM之间的let-7a进行灵敏检测,检出限为0.13 pM。该方法为miRNA的分析检测提供了一种新思路。
【图文】：

示意图,杂交技术,示意图

NAs（miRNAs）是一类内源性小分子 RNA[1]，序列由 18 - 25遍存在于生物体中，在生物体的生长发育、调控基因表达、细活动中起着重要作用。研究表明，miRNAs 的非正常表达与人密切相关[2-4]。因此，miRNAs 作为一种疾病的临床诊断和治疗准确检测尤为重要。然而，由于 miRNAs 序列短，在细胞中的环境要求苛刻，其分析研究面临巨大挑战[5]。因此，开发简单检测新方法具有重要意义。roRNA 的检测方法iRNAs 的核糖核苷酸序列较短，在细胞内含量低，且同源性异性灵敏检测面临挑战[6]。迄今为止，已报道有多种检测 mi要有 Northern Blotting、微阵列芯片法、核酸扩增等。rthern Blotting

放大反应,金纳米粒子,技术结合,探针

河北大学理学硕士学位论文进行分离，，分离出来的 RNA 转至尼龙膜或硝酸纤维素膜固相杂交，通过杂交结果对特异结合的探针分子的图像进行检测、法检测灵敏度低、步骤繁琐耗时、所需样品多，使其在 miRNA制。列芯片芯片是近年来在生物领域中发展起来的一项高通量分析技术tting 法相比，具有样品用量少，时间短等优点，可实现 miRN生化分析和医学研究等领域有重要的应用价值[11-13]。
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;O657.3

【参考文献】