核酸适体编码探针结合微芯片电泳用于食品和生物样品中兽药残留检测的研究

发布时间：2020-04-20 18:25

【摘要】：目前,人们在环境中发现了许多兽药残留,如抗生素、激素等,它们会通过食物链进入人体内,对其健康造成极大的危害。目前,检测这类兽药的难点有以下几点:1、在食物和生物样品中的含量较低(μg/kg);2、基质干扰严重;3、多种兽药同时共存。因此,对食品或生物样品中的兽药残留的检测,迫切需要开发一些高灵敏、高特异且高通量快速的分析方法。本论文通过开发一系列新型的核酸适体编码探针,并结合微流控芯片电泳技术,构建了一系列通用的适体传感器用于高通量快速检测兽药残留(包括:氯霉素、卡那霉素、青霉素和雌二醇等等),并对其分析性能和原理进行了研究。相比于目前的电化学、光学适体传感器,上述的传感器不仅操作简单,小巧便携,而且具有高通量快速、抗基质干扰能力强等优点,在现场检测中具有更为广阔的应用前景。本论文主要分为三部分来开展研究工作:1.基于适体探针的微芯片电泳用于食品中抗生素残留的检测本章工作我们基于微芯片电泳的检测分离技术,开发了一种新型无标记、高通量、自动化的适体传感器用于检测食品中的氯霉素残留。首先,在含有氯霉素的样品中加入适体探针使其充分反应,然后,再向其中加入适体的互补链。由于适体-氯霉素(Apt-CAP)复合物无法与互补链进一步杂交形成dsDNA,所以随着氯霉素的增多,dsDNA会减少。最后,将上述混合物送入微芯片电泳中(MCE)进行检测。MCE可以分离dsDNA和Apt-CAP,并产生不同的荧光信号。在一定浓度范围内,dsDNA与Apt-CAP信号的比值与目标物的浓度成反比。在最佳的实验条件下,该方法对0.008-1.000ng/mL的氯霉素具有良好的线性关系,检出下限为0.003ng/mL。同时,该方法也成功应用于不同食品中氯霉素的检测,显示出良好的回收率(牛奶:91.1-108%,鱼类:86.1-114%),与ELISA的结果相近。该检测方法有以下优点:检测过程简单,速度快,无需信号标记。若是目标物的适体序列不同,就可用于同时检测,具有高通量筛选的潜力,可应用于食品安全中抗生素的高通量筛选。2.基于适体功能化编码磁珠和聚合酶链式反应的微芯片电泳阵列用于同时检测食品中的抗生素本章工作我们开发了基于微芯片电泳阵列的适体传感器用于同时检测卡那霉素(KANA)和氯霉素(CAP)。我们首先将两种捕获探针(C-DNA)修饰到磁珠上,捕获探针的序列分为两部分:一部分是目标物的适体序列,另外一部分是辅助DNA(A-DNA)的互补序列(可与A-DNA杂交形成复合探针)。目标物和C-DNA之间的特异性亲和力会诱导磁珠上的复合探针解旋,A-DNA最终被目标物取代,通过磁性分离分散在上清液中。我们取一定量的上清液,通过聚合酶链式反应(PCR)产生大量相应的dsDNA。由于A-DNA的长度不同,因此扩增后的PCR产物的长度也不同,这些扩增产物可以通过MCE阵列分别进行分离检测,由此对不同目标物实现定量。此外,本方法通过加入内标链减少PCR定量的误差。经历20圈热循环后,该方法对KANA的检测下限为0.0025nmol/L,对CAP为0.0060 nmol/L)。此外,该方法可在1小时内检测48个样品,显示出较高的检测通量,结合适体功能化磁珠的高特异性和PCR的高扩增能力,该方法有望应用于食品中痕量抗生素的同时检测。3.基于可编程发夹探针和等温聚合酶催化目标物循环的微芯片电泳平台用于同时检测尿液中小分子物质本章工作我们基于微芯片电泳和等温聚合酶催化目标物循环的信号放大技术,以苄氨青霉素(AMP),三磷酸腺苷(ATP)和雌二醇(E2)为检测模型,开发了一种均相适体传感器用于尿液中小分子的多重检测。通过目标物诱导识别PHP的区域I,打开了PHP的发夹结构,在相应引物和Bst辅助下进行延伸扩增成dsDNA。被取代的目标物会打开第二个PHP,再次启动了另一个循环,从而实现了等温聚合酶催化目标物循环(IPCTR)。我们通过对PHP中的区域III的特殊设计,使得不同类型的目标物被转换为不同长度的扩增产物,便于MCE分离和检测。该方法充分发挥了微芯片电泳高通量和IPCTR高扩增能力的特点,对尿中三个目标物表现出较高的灵敏性,检测下限分别为1nmol/L(ATP),0.05nmol/L(AMP)和0.1 nmol/L(E2)。该测定方法为不同分析物检测提供了一种简便和通用的平台。
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[21; 25]发展欣欣向荣，已经开始从基础研究走向实际应用。图1.1 芯片实验室示意图[21]Fig. 1.1 The Schematic of “lab on chip”1.2.2 微芯片电泳概述微流控芯片电泳，在本文中简称微芯片电泳，，是传统毛细管电泳的拓展。它不仅继承了毛细管电泳分离效率高、试剂消耗小等优点，同时还具有分析速度快、微型化、更易集成等特点，非常适合多组分的快速分析[28]。将微芯片电泳应用于疾病诊断和治疗、环境监测、新药研究开发、食品安全检测等许多领域，将产生革命性的变化，它已成为当前生物分析化学中重要的发展方向之一。微芯片采用微机电加工技术，通过蚀刻在数平方厘米大小的基片上制作出微米级电泳微流通

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微芯片电泳的进样通道结构示意图
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O658.9;TS207.5

【参考文献】