荧光相关光谱测定酶活性新方法研究

发布时间：2020-05-08 10:37

【摘要】：酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)。酶活性的异常通常与一些重大疾病相关。酶活性的测定已成为基础研究、疾病早期诊断、药物筛选以及靶向治疗的重要方法。传统的酶活性测定方法需要试剂的量大、费用高、分析时间长,因此需要开发灵敏、快速、微量的分析新方法。荧光相关光谱法(Fluorescence correlation spectroscopy,FCS)是一种单分子检测方法,具有灵敏度高、分析时间短、检测体积小等优点,适用于酶活性的测定和酶抑制剂的筛选。本论文建立了FCS检测端粒酶活性的新方法,发展了微孔芯片-荧光相关光谱(Microwell chip-fluorescence correlation spectroscopy,MC-FCS)系统,并以MC-FCS系统进行了含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)活性的检测研究。本论文的主要内容包括以下的几个方面:(1)将单分子荧光相关光谱(FCS)与端粒酶重复扩增法(Telomerase repeat amplification protocol,TRAP)相结合,发展了一种超灵敏和可靠的定量测定端粒酶活性的新方法(TRAP-FCS)。端粒酶是一种维持端粒长度的关键酶,且由于其在癌症和衰老中的重要作用,被认为是一种通用的癌症生物标志物和潜在的药物靶标。由于端粒酶在细胞内的含量水平非常低,因此有必要开发一种灵敏可靠的端粒酶活性检测方法。TRAP-FCS方法的原理是利用FCS对TRAP产物的特征扩散时间和粒子数目的变化进行测量。其特征扩散时间与TRAP产物的长度有关,粒子数目代表了TRAP产物的浓度。实验优化了TRAP程序和FCS检测的条件。我们发现,端粒酶活性与TRAP产物在最佳实验条件下的特征扩散时间和粒子数呈正相关。该方法成功地测定了不同细胞个数和细胞系的端粒酶活性,实现了单个细胞检测。同时,采用该方法对抑制剂的抑制效果进行了评价,得到IC_(50)值与文献资料基本一致。与目前的TRAP方法相比,该方法具有可靠的定量、超高的灵敏度、较短的检测时间和无需分离等优点。我们认为TRAP-FCS方法在端粒酶活性检测的临床诊断和药物筛选中具有潜在的应用价值。(2)自行制作了一种PDMS/玻璃的微孔芯片,实现其与FCS检测方法联用,建立了MC-FCS方法。首先制作了适合于FCS检测的PDMS/玻璃微孔芯片。采用薄膜封装减小了芯片孔中微量的样品蒸发,还采用表面活性剂动态修饰的方法消除了样品的非特异性吸附。在优化后的条件下,玻片和芯片上的样品检测结果基本一致,微孔芯片成功地用于荧光相关光谱系统检测。优化了芯片孔径的大小,芯片最佳孔径为0.9 mm。进而,我们优化了样品溶液的体积,显著地减少样品体积至1μL。MC-FCS系统与现有的FCS方法相比,显著地减少了样品和试剂体积,极大地降低了酶活性测定和药物筛选的成本。(3)基于MC-FCS技术,提出了Caspase-3活性及其抑制常数测定新方法。Caspase-3是细胞生物个体发育和体内平衡过程中细胞凋亡的关键酶,而且是治疗细胞凋亡相关疾病中一个非常重要的潜在药物靶点。到目前为止,还没有用于Caspase-3靶点的商业药物,因此急需开发Caspase-3活性检测和抑制剂筛选的有效方法。我们方法的原理是基于FCS测量酶反应动力学和均相检测酶反应的产物。该MC-FCS系统可以显著地降低样品体积至1μL。实验使用了荧光染料和生物素双重标记的Caspase-3底物。在产物中添加的链霉亲和素不仅可以快速地终止酶反应,还由于增大了分子量差距使得反应产物也可以被FCS选择性的检测。我们将FCS理论与酶反应动力学结合,建立了Caspase-3抑制剂的筛选模型。该新方法成功地用于抑制剂的抑制常数的测定以及药物诱导细胞凋亡的检测。与现有的方法相比,该方法灵敏度高、试剂用量小、分析时间短。我们相信该系统和方法将成为对Caspase-3抑制剂筛选和细胞凋亡检测的有效平台。
【图文】：

4图 1-1 FCS 检测的基本原理。Fig.1-1 Principle of FCS detection.通过荧光波动自相关函数拟合得到的自相关曲线可以提供以下几个方面的信息：拟合曲线 G(0)值的大小反比于检测微区内荧光分子的平均数量；曲线随时间衰退的速率和形态可以显示出检测微区内荧光分子扩散变化的动力学特征；依据荧光强度和荧光分子的数量还可以得到单个粒子的荧光强度等。归一化的 FCS 曲线如图 1-2A 所示，随着荧光分子的结合变大和特征扩散时间的变慢，FCS 的曲线会逐渐右移。自相关 FCS 曲线如图 1-2B 所示，随着荧光分子浓度的增加，粒子数目增加，，FCS 的曲线 G(0)值的大小会逐渐下降。这是当 FCS 的曲线发生变化时所代表的意义。通过计算可以得到荧光分子的浓度、扩散系数、反应常数等一系列重要的参数。

5S 的曲线变化图。（A）归一化的 FCS 曲线反映了扩散时间和分子大（B）FCS 曲线反映了粒子数和浓度的变化。inciple of FCS detection. (A) Normalized autocorrelation curves reflect thtime and molecular size. (B) FCS autocorrelation curves reflect the changnumbers and concentration.FCS 的理论公式微区内荧光信号的强度在任一时间 t 的变化引起的涨落值为：F(t) = F(t) - F(t)
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q55;O657.3

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本文编号：2654545