基于目标物结合诱导效应构建的荧光生物传感器用于蛋白质检测

发布时间：2020-05-27 19:57

【摘要】：蛋白质是组成细胞的重要成分,其灵敏和特异性检测对于分子诊断和医药研究具有重要意义。转录因子是一种DNA结合蛋白,通过结合特定区域来调节基因的表达。转录因子表达异常会引起炎症,癌症等相关疾病,已成为诊断研究的标志物。末端转移酶是一种非模板依赖性的聚合酶蛋白,可在DNA链末端添加重复的核苷酸序列,是急性白血病的生物标志物。因此,转录因子和末端转移酶的灵敏和特异性检测对于临床诊断和病理研究具有重要的意义。目标物结合诱导效应是一种通过目标物蛋白与DNA链结合,在空间上形成位阻或者改变DNA结构从而对下一步反应起到保护或触发作用的策略。这种策略可将蛋白质的特异性检测转化为核酸检测,同时易于结合核酸放大方法,提高目标物蛋白利用率,为实现蛋白质特异性灵敏检测提供了平台。DNA纳米机器是一种利用DNA结构可编程,多样性以及可控性特点进行的DNA纳米组装,能够依据能量的转化实现持续运动。能量转化通常是由链取代、酶反应和环境变化引起的。DNA纳米机器的研究对靶向给药,细胞内物质输运,纳米尺度装配等领域有重要意义,可作为生物传感器用于目标物分析。利用目标物结合诱导效应,我们构建了对转录因子和末端转移酶进行特异灵敏检测的荧光生物传感器。本文共分为三章:第一章为绪论,概述了结合蛋白转录因子和酶蛋白末端转移酶的检测意义及其传统检测方法,介绍了目标物结合诱导效应的基本原理及其分类,此外介绍了DNA纳米机器的概念及其发展,基于驱动机制的不同可分为三类,主要为环境因素驱动,酶驱动以及链取代驱动。第二章基于目标物结合保护作用介导的滚环扩增,建立一种荧光传感器用于转录因子的灵敏特异性检测。通过转录因子与特定DNA序列结合形成的空间位阻抑制Nt.BbvCI的切割,保证检测的特异性。此外设计多功能发夹探针可同时用于结合目标物,识别Nt.BbvCI,输出信号,连接后作为滚环扩增模板,避免了多种探针的复杂设计以及添加模板所带来的非特异性扩增。本方法实现了对目标物TBP的灵敏检测,检测限低至88 pM,线性范围为100 pM到40 nM,展现了较高的特异性。第三章基于目标物结合诱导延伸构建一种DNA walker纳米机器用于末端转移酶检测。通过目标物末端转移酶与W链的3'羟基末端结合,诱导其延伸生成具有活性位点的walker链从而启动DNA纳米机器。同时利用λexo切割基质链驱动荧光团不断释放,放大检测信号,实现对目标物的灵敏检测。目标物未与W链结合时无法产生活性位点,有效避免非特异性启动带来的背景信号。本方法的检测限为7 U/mL,且具有较高的特异性。
【图文】：

三螺旋结构的出现也被应用于结合诱导的构象转变中，如Ｊｉａｎｇ课题组巧妙逡逑设计一种Ａｇ＋稳定的三螺旋结构，然后结合目标物诱导构成一种可开可关的分子逡逑组装实现了邋ＴＦ的检测３２，如图１．２，，ＤＮＡ双链上含有ＴＦ的结合位点，且与单逡逑链ＤＮＡ结构有部分重叠的相似碱基，单链的结构可以和双链共同形成三螺旋结逡逑构，而Ａｇ＋在这个过程中起到了增加结构稳定性的效果，这时两种信号分子会由逡逑于距离的拉近发生ＦＲＥＴ，不发荧光。ＴＦ存在时，与双链ＤＮＡ有较强的结合作逡逑用力使三螺旋结构不稳定将寡核苷酸链取代下来，这种作用力破坏了稳定的三螺逡逑旋结构，使其又变成双链完成结构转变，信号分子相互远离恢复荧光。这种构象逡逑转变过程其实是目标物诱导的结合竞争，通过荧光分子开关实现对ＴＦ的特异性逡逑检测。逡逑0邋＋逦￣￣＾邋４邋＋邋＞逡逑＞邋＾邋ｉＨ邋Ｐ邋＂逡逑ｒ逦％逡逑ＢＨＱ－１ＴＴＯ逦ＡＴ邋ＳＴ１＞ＭＳ逦0？＊逡逑＂Ｔｔｔｒａ邋ｏｆＴ逡逑图１．２目标物结合诱导ＤＮＡ竞争结合３２逡逑３逡逑

对ＤＮＡ单链进行末端切割的一种外切酶，可对３’突出末端进行逐步降解。逡逑Ｚｈａｎｇ课题组基于目标物结合诱导保护的原理结合Ｅｘｏ邋ＩＩＩ和Ｅｘｏ邋Ｉ切割过程逡逑建立ＴＦ的放大检测策略３３，如图１．３所示，ＴＦ与发夹茎部结合后会产生强大的逡逑空间位阻，阻碍Ｅｘｏ邋ＩＩＩ对３’平末端的切割降解过程，从而保护与目标物识别的逡逑发夹探针，发夹随后与引物碱基配对，结构稳定后与聚合酶结合在末端添加互补逡逑序列，得到双链ＤＮＡ，此时再加入ＤＮＡ解旋酶，双链从两端发生解旋再次与引逡逑物聚合酶作用完成双链扩增过程，最后在双链ＤＮＡ中插入荧光信号分子完成检逡逑测。而没有与目标物结合的过量识别探针则会经两种外切酶共同作用逐步降解为逡逑ＤＮＡ碎片。逡逑９９９逦＂邋ｍ逦＇＂ｔ逡逑Ｐｙ邋ｈ邋Ｍ－逦（邋Ｈｅｌｉｃａ＾ｎｄｅｎｔ逡逑ｌ逦ａｍｐｕｆｉｃａｔｉｏｎ逦Ｊ逡逑Ｅｘｏ邋ＨＩ邋｜邋Ｅｘｏ邋Ｉ逦＾邋ｗ逡逑ｔ逦￣＞ＴＴＴＴＴ７ｍｇ３逡逑５３＇邋５１邋ｆ逡逑Ｉ邋ＩＩｅ＞ｔ逦＜邋Ｈｃｌｋ咖逡逑Ｉ邋Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ逡逑＾邋＊逦Ｐｒｉｍｅｒ逡逑Ｙ邋＾逦？逦５，逡逑Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ逡逑图１．３目标物结合外切酶保护分析３３逡逑目标物结合形成的空间位阻抑制外切酶切割，Ｚｈａｎｇ课题组也利用此原理逡逑建立一种ＴＦ的放大检测方法３４，当ＴＦ存在时，与识别探针结合形成空间位阻逡逑可以抑制Ｅｘｏ邋ＩＩＩ的非特异性切割
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3

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本文编号：2684057