基于碱基切除修复的荧光生物传感策略用于尿嘧啶-DNA糖基化酶活性检测

发布时间：2020-06-22 09:13

【摘要】：尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)对DNA中尿嘧啶特异性识别和移除,属于尿嘧啶损伤修复蛋白,它通过识别DNA中的尿嘧啶并切断尿嘧啶与脱氧核糖之间的N-糖苷键来移除尿嘧啶(U)碱基,产生无碱基或无嘧啶(AP)位点,启动碱基切除修复路径,然后结合其他蛋白酶完成整个DNA损伤修复过程。它在碱基切除修复路径中具有重要的作用,可维持基因组完整性。鉴于以上分析,本文利用碱基切除修复的荧光生物传感方法对UDG活性进行灵敏、准确检测。本文共分为三章:第一章为绪论,概述了碱基切除的产生原因和机理、UDG的结构和功能、研究意义以及分析归纳了目前关于UDG活性的传统检测方法和新型生物传感检测方法,并指出检测方法中存在的问题。第二章构建了一种基于自引物自模板循环滚环扩增(Self-RRCA)策略用于UDG活性的灵敏和准确检测。首先,设计了含有一个U的不成熟的模板链,它与引物链部分互补,形成一个前体扩增子识别探针。经UDG和内切酶Ⅳ(endoⅣ)作用后,前体扩增子探针发生构象转变,进而形成一个RCA扩增子。然后RCA扩增子被用于触发RCA反应,经Nt.BbvCI切刻酶作用,新的扩增子被释放来触发下一轮RCA,这就构成了一个Self-RRCA。在这个方法中,设计的不成熟模板与引物在连接部分不完全互补,这可有效地避免非特异性连接,最终有效地避免非特异性扩增。相比线性RCA,Self-RRCA展现了更高的扩增效率。由于以上优势,本方法实现了 UDG的灵敏和准确检测,检测限低至510-5U mL-1。而且,这个方法用于筛选UDG抑制剂和分析HeLa细胞裂解液中的UDG活性。这个方法将会提供一种有前景的分析工具用于进一步的UDG生物研究和临床诊断。第三章构建了一种基于内源性酶触发的DNA walker用于胞内检测UDG活性。首先,金纳米颗粒上修饰有3'端标记荧光团FAM的且含有U碱基的底物链(SR)和DNAwalker链(DW)。由于荧光共振能量转移,金纳米颗粒将SR上荧光淬灭掉。其次,DW上有一部分与SR碱基互补,在目标物UDG作用下,尿嘧啶碱基被移除,产生AP位点。紧接着在AP内切酶(APE1)作用下,将AP位点切割,底物链被切断后荧光恢复。随后,DW继续与下一条SR杂交,产生增强的荧光信号。此策略中,首先,DNA walker的运行是由胞内内源性酶触发的,无需外加蛋白酶或其他任何物质,保证了 DNAwalker在胞内的正常运行。其次,由于金纳米颗粒上DNA局部浓度增大,可进一步促进酶切反应和底物链的卸载,这有利于DNA walker的快速反应和荧光释放,最后,由于DNA负载到金纳米颗粒上可有效避免胞内核酸酶对DNA链的降解。本文提出的这一策略将为胞内检测其他DNA修复酶提供一个重要的工具。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3
【图文】：

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图ｉ．ｉ碱基切除修复路径示意图２４逡逑啶－ＤＮＡ糖基化酶概述逡逑啶－ＤＮＡ糖基化酶的结构和功能逡逑啶－ＤＮＡ糖基化酶（ＵＤＧ）是ＤＮＡ糖基化酶中的一种，属于白，分子量大约为３７邋ＫＤａ，属于小的单体蛋白，无需其他辅因其活性２８。它是高度保守型的，由４个平行的贝塔折叠和８个而且４个平行的贝塔折叠是由８阿尔法螺旋包围着，其二级

示意图,结构示意图,脱氧尿苷,贝塔

着、春４逡逑＃＃逡逑ｗｕ？，／逡逑图１．３邋ＵＤＧ作用于ＤＮＡ的示意图３５＿３７。逡逑注：含脱氧尿苷的ＤＮＡ绑定到ＵＤＧ的被８个阿尔法螺旋包围着的四条平行贝塔折叠逡逑的Ｃ－末端边缘。脱氧尿苷核苷酸从碱基堆里翻转过来进入酶活性位点。逡逑３逡逑

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