农产品真菌毒素DNA诱导组装与多色免疫快速检测方法研究

发布时间：2020-07-10 05:54

【摘要】：真菌毒素是一类由真菌产生的有毒次生代谢产物,可致癌、致畸、致突变。真菌毒素可污染“农田到餐桌”的任一环节,防控难度大。由于我国农业环境气候差异大,真菌毒素混合污染的情况频繁发生,且多毒素联合毒性强,严重威胁人民群众生命健康。现场快速检测技术是农产品真菌毒素全程监管的重要技术手段,现有真菌毒素快速检测ELISA法、试纸条法等需要复杂的分离、洗涤等步骤,且多仅能用于单一毒素的检测,难以满足真菌毒素简便前处理以及混合污染现场同步检测的需求。因此,亟需建立真菌毒素快速简便检测技术。针对以上问题,我们研究建立了三种快速简便的免疫分析方法。主要研究内容和创新点如下:1.研究建立了黄曲霉毒素B_1荧光共振能量转移免疫分析方法,无需任何分离步骤,简便、易操作,满足黄曲霉毒素B_1快速简便的检测需求。基于荧光共振能量转移、胶体金的荧光猝灭特性以及竞争免疫反应,根据荧光值变化实现黄曲霉毒素B_1定量检测。将胶体金作为荧光猝灭基团及抗体标记的支架,根据抗原抗体特异性反应,猝灭抗原上的羧基荧光素。该方法线性范围为10.0-60.0 nmol/L,检测限为8.6 nmol/L。该方法为均质检测,整个检测过程可以在同一个试管中完成,无需任何洗涤、分离,简化了操作步骤,可以广泛应用于黄曲霉毒素B_1的现场检测。2.研究建立了黄曲霉毒素B_1 DNA诱导组装荧光检测技术,显著降低了荧光背景值,首次实现真菌毒素等小分子DNA诱导组装荧光检测。结合DNA诱导组装技术、胶体金荧光猝灭特性和竞争免疫反应,建立DNA诱导组装荧光检测技术。该研究通过设计识别元件和信号元件,实现了DNA诱导组装技术在真菌毒素等小分子检测中的应用。该方法检测限为2.3 nmol/L,线性范围为5.0-50.0 nmol/L。将该方法应用于大米实际样品中黄曲霉毒素B_1的检测,加标回收率为86.2%-101.6%。对荧光基团和猝灭基团之间的距离进行理论估算,结果表明与传统免疫荧光检测相比,该方法大大缩短了两者之间的距离,降低了约38%的荧光背景,提高了灵敏度。3.研究建立了真菌毒素混合污染多色免疫层析同步检测技术,实现三种真菌毒素混合污染的同步检测。研制出能够同时检测三种真菌毒素的多色同步免疫层析试纸条。利用不同颜色的微球标记不同的单克隆抗体,在三条检测线上分别固定黄曲霉毒素B_1、T-2和玉米赤霉烯酮抗原,利用竞争免疫反应实现三种毒素的同步检测,其可视检测限分别为1.6、64.2、6.3 nmol/L。三种毒素之间无交叉反应,试纸条特异性好。该方法在玉米和饲料样品中的检测结果与HPLC-MS/MS分析结果具有良好的一致性。该方法仅通过辨别检测线颜色即可实现三种真菌毒素的半定量检测,操作简便、成本低。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3;TS207.5
【图文】：

真菌毒素,食物链

学院博士学位论文第一章引言毒素的危害素（mycotoxin）是由真菌（fungal）产生的有毒次生代谢产物。常见的产菌（Aspergillus）、青霉属真菌（Penicillium）和镰刀菌属真菌（Fusarium）目前，已知的真菌毒素有 300-400 种，常见的真菌毒素有黄曲霉毒素、玉米和 T-2 毒素等。这些毒素可以在种植、收获、储存、加工和运输等任一阶Eletal.2011）。真菌毒素具有极强的毒性，如致癌、致畸、致突变、抑制免于食品添加剂和农药残留，严重影响人类和动物健康，甚至威胁生命（Zheal.2007）。真菌毒素在食物链中的影响和危害如图 1.1 所示。一方面，真菌接污染农产品；另一方面，真菌毒素污染的农产品被动物摄入，在动物体内康并间接污染动物性食品（如奶制品等）。真菌毒素污染的植物性食品或膳食影响人体健康。真菌毒素污染引发的召回及下架，造成了巨大的经济

黄曲霉毒素,免疫亲和色谱,节点时间,乙型肝炎病毒

中国农业科学院博士学位论文第一章引言成，促进了黄曲霉毒素毒理学和代谢的相关研究。1977 年，科研工作者完成了 AFT-DNA 加成物的结构鉴定，并于 1981 年在小鼠尿液中发现了 AFT-DNA 加成物。随后，在抗黄曲霉毒素单克隆抗体合成的基础上，研究建立了尿液中 AFT-DNA 加成物的检测方法。该 DNA 加成物的检测为黄曲霉毒素分子流行病学的研究提供了有效的工具。在中国和非洲撒哈拉以南地区有关黄曲霉毒素分子流行病学的研究结果，为黄曲霉毒素被划分为 1 类致癌物提供了科学依据。

玉米赤霉烯酮,哺乳动物

霉烯酮（zearalenone,ZEN）主要是由镰刀菌属（Fusarium）产生的一种类赤霉病的玉米中分离得到的，它可以污染玉米、小麦、大麦、燕麦和 et al. 2012）。玉米赤霉烯酮为白色晶体，熔点为 164℃-165℃，不溶于醚、苯、氯仿等各种有机溶剂。玉米赤霉烯酮具有良好的热稳定性，在。霉烯酮是一类非甾体雌激素，因为和雌激素结构相似，它具有很强的生殖类和动物健康。结构上玉米赤霉烯酮像人工合成的雌激素，可以与真正动物体内的雌激素受体，从而改变生殖器内部或者外部结构，影响人类或玉米赤霉烯酮还具有一定的基因毒性、免疫毒性、细胞毒性、遗传毒性ssema et al. 2007; Bakos et al. 2013; Cai et al. 2012; Gao et al. 2016; Gaum玉米赤霉烯酮在哺乳动物体内的代谢途径（MartinaKleinovaetal.2002edine et al. 2007）。在 3α-和 3β-羟基-类固醇脱氢酶的催化下，羟基化反米赤霉酮中的羰基还原为羟基，玉米赤霉烯酮转化为 α-和 β-玉米赤霉烯可以在牛和羊体内进行更进一步的还原，通过尿液排至体外。因此可以醇；如在猪的尿液和肌肉组织中可以明确检测到玉米赤霉醇。对玉米赤同动物组织中的研究，可以用来指导人类营养学。

【相似文献】