基于split GFP的分析传感体系的构建及转肽酶的活性检测

发布时间：2020-08-07 07:02

【摘要】：绿色荧光蛋白因其自身具有荧光和易进行基因编码的独特性质,已作为强有力的分子工具被广泛用于生命科学研究中。随着生物学手段和技术的不断发展,人们在对绿色荧光蛋白的深入研究过程中,开发出了许多基于绿色荧光蛋白的分析传感检测体系。其中基于GFP自发荧光和可拆分为不发荧光的片段分子的性质所发展的split GFP的荧光互补体系,因其具有免标记和信背比高的优势,非常适合用于生化分析传感平台的开发。我们课题组曾报到过基于双分子split GFP体系(10+1体系)设计传感器检测激酶活性。本文中,我们利用GFP1-9作为荧光信号的报告因子,构建了一个基于三分子split GFP互补体系(9+(1+1)体系)的简单通用的传感平台,用于与革兰氏阳性菌侵染过程密切相关的转肽酶活性检测。同时,也开展了基于双分子split GFP体系细胞膜表面成像方面的研究。具体工作如下:1.三分裂split GFP体系的构建及优化。通过质粒的构建和诱导表达获得纯度较高的GFP1-9蛋白。同时验证了GFP1-9与人工合成的GFP10-11互补多肽片段之间能发生复合反应,并对复合反应的时间和反应过程中两者的比例进行了最优条件的探讨。该工作为后续生物传感体系的设计和实验进行奠定了基础。2.三分裂split GFP作为传感平台用于转肽酶的活性分析及其抑制剂的筛选。文中,基于三分子split GFP荧光互补体系,开发了一个灵敏的荧光turn-on的生物传感器用于转肽酶活性及其抑制剂的筛选。转肽酶能催化含有其识别序列的GFP10和GFP11发生转肽反应,反应产物多肽GFP10-11能与GFP1-9互补形成完整的GFP蛋白并伴随着荧光信号的恢复。该分析方法具有较宽的线性检测范围(0.3-100 nM)和低的检测限(0.16 nM)。另外,因其“一锅法”的简单操作手段,可用于转肽酶抑制剂的高通量筛选。此外,本分析方法的特异性和良好的抗干扰能力,使其具有可进一步应用到复杂体系中转肽酶的检测和实际食品中革兰氏阳性菌的分析的潜力。3.哺乳动物细胞膜上双分子split GFP体系的构建。基于双分子split GFP荧光互补体系,通过真核细胞表面表达载体pDisplay构建的pDisplay-gfp1-10质粒,实现了在哺乳动物细胞膜外侧表达GFP1-10大片段蛋白,并能与外源加入的GFP11多肽互补,为双分子split GFP互补体系在细胞膜表面蛋白酶或分泌性酶的检测方面提供了可能性。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3;Q55
【图文】：

基于 split GFP 的分析传感体系的构建及转肽酶的活性检测色团相连接的 σ 螺旋。其中，反平行的 β 折叠是由 9-13 个氨基酸组β 折叠是通过氢键相连，并形成紧密封闭的桶状结构，荧光基团被包含内。这种特殊的立体结构使绿色荧光蛋白的生色团被很好的保护在桶免受溶液中水合氢离子的碰撞和氧分子的猝灭[13-15]，因此，GFP 的化

基于 split GFP 的分析传感体系的构建及转肽酶的活性检测接的 σ 螺旋。其中，反平行的 β 折叠是由 9-13 个氨基过氢键相连，并形成紧密封闭的桶状结构，荧光基团被特殊的立体结构使绿色荧光蛋白的生色团被很好的保护中水合氢离子的碰撞和氧分子的猝灭[13-15]，因此，GFP图 1.1 GFP 的二级结构和三维立体结构示意图。

基于 split GFP 的分析传感体系的构建及转肽酶的活性检测，因此可以用 GFP 对细胞内的 pH 进行检测。这种基于 G光探针通常被称为 Phluprin，分为比率型和盈缺型两种。低时，最大激发波长的位置会从 395 nm 迁移到 475 nm，度之间的比例来对 pH 值进行定量检测分析；而盈缺型，只在 395 nm 波长处存在荧光响应。因此，利用绿色荧光5-7.1 范围内的变化，并成功对线粒体、高尔基体和细胞质anson 等在 2002 年报道了一系列新型的 GFP 突变体（de pH 探针检测细胞内的 pH[25]。

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 张敏;任慧霞;;绿色荧光蛋白在药学研究中的应用[J];中南药学;2008年01期

本文编号：2783656