癌细胞中端粒酶活性检测方法的应用研究

发布时间：2021-04-10 04:27

　　人端粒酶是由人端粒酶逆转录酶催化亚基组成的蛋白质复合物,该复合物以自身的RNA组分为模板,在染色体末端添加TTAGGG重复序列。端粒酶活性可在大多数原发性人类肿瘤标本和肿瘤衍生细胞系中检测到。大多数正常的人类细胞缺乏端粒酶活性,端粒随着细胞分裂而缩短,直到无法缩短而凋亡,除了在少数增殖细胞中表达,如生殖细胞和干细胞。在大多数永生细胞和癌细胞中,核糖核蛋白端粒酶通过在染色体末端添加TTAGGG重复序列来维持端粒长度,使细胞分裂过程中的DNA损伤得到修复并使细胞可以无限增殖,甚至永生。端粒酶的维持机制是无限复制潜力的基础,是癌症诊断的生物标志物。端粒酶的有效检测对生物学和疾病诊断等方面具有重要的意义。因此,端粒酶的特异性、准确性及灵敏性检测极具前瞻性。为了更好地测定人类恶性肿瘤中端粒酶的生物学意义和临床意义,需要对端粒酶活性进行准确的检测。本文采用无淬灭分子信标标记的二次信号放大策略超灵敏检测端粒酶的方法,利用端粒酶的存在可以催化端粒重复单位（TTAGGG）n添加到端粒酶底物链的3’末端,产生端粒重复的端粒酶延伸产物。随着DNA聚合酶的加入,引物沿着模板延伸取代端粒酶延伸产物形成双链。同时... 

【文章来源】：山东师范大学山东省

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

端粒重复扩增法示意图

山东师范大学硕士学位论文8图1-2杂化链式反应示意图。1.3.3滚环扩增法滚环扩增法（Rollingcircleamplification,RCA）是一种由DNA聚合酶介导的恒温酶促过程，在基因组学、蛋白质组学、生物传感、药物发现等领域有着重要应用。Zhang等[77]提出了一种在绝对等温条件下“混合-检测”一步法超灵敏的检测癌细胞中端粒酶活性的方法。如图1-3所示，引物的3′末端在端粒酶作用下不断添加端粒重复单元（TTAGGG）以形成长的单链DNA，具有脱嘌呤/脱嘧啶位点的辅助探针可以与所得的延伸产物完全杂交以形成稳定的双链DNA。端粒引物在DNA聚合酶和切割酶存在的情况下与延伸序列结合，引发链置换反应，产生RCA引物。游离3′OH末端的新DNA引物可与环状模板杂交，在聚合酶存在下引发滚环扩增反应，产生大量长的重复与信号探针互补的DNA序列，启动核酸内切酶诱导的信号探针的循环切割，以释放大量荧光分子，实现了对单细胞内端粒酶活性的检测。此方法巧妙地设计了引物产生滚环扩增（PG-RCA）反应，设计简约，采用一步法和一管法，只需将检测所需的探针和酶一起加到反应管中，在恒温条件下即可检测端粒酶活性，操作简单，耗费时间少，其端粒酶的检测限低至3个细胞，可以进一步应用于端粒酶抑制剂的筛选和癌细胞与正常细胞的鉴别。

山东师范大学硕士学位论文9图1-3滚环扩增法示意图。1.3.4指数扩增反应指数扩增反应技术（Exponentialamplificationreaction，EXPAR）利用扩增模板合成寡核苷酸，Tian等[78]发明了一种新型的、灵敏的、简单可靠的端粒重复指数等温扩增(EXPIATR)实验法体外测定细胞提取物中的端粒酶活性。如图1-4所示，通过两个引物中Nt.BspQI识别（红色）序列的结合，DNA扩增可以在一个固定的温度下进行，通过切口酶可以切割双链DNA（ds）中一条单链上的识别位点，聚合酶可以延伸3"末端的缺口，并取代下游的链。在端粒酶存在时NTS引物可作扩增模板，延伸的NTS端粒模板与NFRP引物的杂交聚合作用，在延伸的NTS模板上形成缺口，并促使聚合反应从缺口向相反方向进行；与此同时，新形成的链随后打开NFRP底物的发夹结构，激活切口酶的识别位点，并在下游开始切割和延伸/置换反应。解离的单链片段重复之前延伸、切割和解离的过程，继续合成其它新的双链DNA。在这个过程中，每个双链DNA也会生成单链片段，从而达到指数扩增的目的。EXPIATR无需昂贵的热循环实验仪器，就可使其具备快速诊断病原体的能力；实验操作简单，将粗细胞提取物与反应主混合物混合即可，即单个HeLa癌细胞中的端粒酶活性检测可以在25min完成，实现超高速检测，可应用在实时现场检测与监测领域，如突发公共卫生事件的现场诊断。EXPIATR采用闭管法测定，结果可靠，重现性好，已被广泛应用于蛋白质、DNA和多种微生物的检测。


本文编号：3128957