Sunxiuqinia sp.SH-52的海藻酸裂解酶及海藻酸降解机理的研究

发布时间：2021-10-30 17:58

　　海藻酸裂解酶是一种重要的工具酶,广泛应用于寡糖制备、生物能源生产和制药工程等领域。海藻酸分解菌拥有复杂的海藻酸分解系统,往往在其基因组包含多个海藻酸裂解酶基因,这些酶在海藻酸降解过程中的作用模式和适应环境条件变化的生物学意义研究的较少。本文研究了Sunxiuqinia sp.SH-52的海藻酸裂解酶SHA-6的酶学性质,在此基础上分析了来自该菌的6种海藻酸裂解酶对不同环境条件的响应,同时制备了海藻酸寡糖的制备以及不同海藻酸裂解酶的降解机理进行初步研究,获得结果如下:1.海藻酸裂解酶SHA-6的原核表达及酶学特性分析SHA-6基因的大小为2040 bp,编码679个氨基酸,属于PL17家族,包含两个结构域Alginate lyase和Heparinase-II/III,对该基因成功克隆并异源表达后,酶活可达13.5 U/mg,最适pH为7.0;最适温度为50℃;偏好性降解海藻酸;Na⁺能促进SHA-6的酶活,而Zn²⁺和Cu²⁺抑制其活性。2.不同环境对6种海藻酸裂解酶基因表达的影响运用实时荧光定量PCR（QPCR）的方法... 

【文章来源】：昆明理工大学云南省

【文章页数】：116 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词
第一章 绪论
    1.1 海藻酸及海藻酸寡糖的应用前景
        1.1.1 海藻酸的来源
        1.1.2 海藻酸的化学结构和特性
        1.1.3 海藻酸寡糖的制备
        1.1.4 海藻酸及其寡糖的生物学功能
    1.2 海藻酸裂解酶及其研究现状
        1.2.1 包涵体变复性常见问题及解决手段
        1.2.2 海藻酸裂解酶的来源和分类
        1.2.3 海藻酸裂解酶结构域的分析
        1.2.4 海藻酸裂解酶的应用
    1.3 微生物降解海藻酸机理的研究现状及存在问题
        1.3.1 海藻酸降解机制的研究现状
        1.3.2 海藻酸降解机制研究中存在的问题
    1.4 海藻酸结构的鉴定
        1.4.1 酶解产物的分离纯化和检测
        1.4.2 酶解产物的结构分析
            1.4.2.1 NMR
            1.4.2.2 MS
    1.5 研究意义及研究内容
        1.5.1 研究意义
        1.5.2 研究内容
第二章 海藻酸裂解酶的克隆表达及酶学性质研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 所用主要试剂及其配制
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 培养基配方
    2.2 实验方法
        2.2.1 聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸的制备
        2.2.2 引物设计与合成
        2.2.3 Sunxiuqinia sp.SH-52的基因组提取
        2.2.4 海藻酸裂解酶基因的PCR扩增
        2.2.5 琼脂糖电泳检测及目的片段回收纯化
        2.2.6 质粒的提取
        2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
        2.2.8 PCR产物的TA克隆
        2.2.9 目的基因与表达载体的连接
        2.2.10 目的蛋白的表达与纯化
        2.2.11 包涵体蛋白的复性及纯化
        2.2.12 酶活测定及酶学特性分析
        2.2.13 统计处理
    2.3 实验结果
        2.3.1 聚甘露糖醛酸PolyM和聚古罗糖醛酸PolyG的制备
        2.3.2 Sunxiuqinia sp.SH-52海藻酸裂解酶的系统进化分析
        2.3.3 Sunxiuqinia sp.SH-52海藻酸裂解酶SHA-6的原核表达及酶特性分析
    2.4 小结
    2.5 讨论
        2.5.1 海藻酸裂解酶的序列及结构域分析
        2.5.2 海藻酸裂解酶的包涵体解决
        2.5.3 海藻酸裂解酶的酶学性质
第三章 不同环境条件对SH-52菌株海藻酸裂解酶表达的影响
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要试剂及配制
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 去RNase处理
        3.1.4 主要培养基
    3.2 实验方法
        3.2.1 海带处理液的配制
        3.2.2 引物设计与合成
        3.2.3 不同环境下菌体的生长
        3.2.4 RNA的提取
        3.2.5 去除基因组DNA
        3.2.6 反转录cDNA
        3.2.7 标准曲线的建立
        3.2.8 QPCR
        3.2.9 相对定量分析
        3.2.10 粗酶液的提取
        3.2.11 统计处理
    3.3 实验结果
        3.3.1 转录水平测定
    3.4 酶活水平的测定
        3.4.1 不同碳源下的粗酶活
        3.4.2 不同温度下的粗酶活
        3.4.3 不同pH下的粗酶活
    3.5 小结
    3.6 讨论
第四章 海藻酸寡糖的分离与分析
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株和酶
        4.1.2 主要试剂及其配制
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 主要培养基
    4.2 实验方法
        4.2.1 甘露糖醛酸寡糖混合物的制备
        4.2.2 甘露糖醛酸和古洛糖醛酸寡糖混合物的分离
        4.2.3 阴离子柱分离样品
        4.2.4 TLC检测
        4.2.5 SephadexG-10柱脱盐
        4.2.6 海藻酸裂解酶降解产物的制备
        4.2.7 ~1H-NMR分析
        4.2.8 衍生化HPLC分析
        4.2.9 质谱分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 甘露糖醛酸和古洛糖醛酸寡糖混合物的分离和纯化
        4.3.2 海藻酸裂解酶反应历程的分析
        4.3.3 应用所建立方法对海藻酸裂解酶的降解产物分离纯化
    4.4 小结
    4.5 讨论
第五章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
致谢
参考文献


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3467172