基于核酸外切酶Ⅲ辅助的DNA扩增策略构建荧光生物传感器的研究
发布时间：2022-01-07 21:00
核酸外切酶III（Exo III）由于不需要特定识别序列就能选择性识别并水解双链DNA的3’平末端或3’凹末端,它在构建DNA信号扩增的生物传感器方面有着广泛的应用。随着对小分子和蛋白质之间相互作用的深入研究,小分子部分与其蛋白质目标结合产生的空间位阻可以保护末端与小分子相连的单链DNA（ss DNA）。这种小分子DNA的末端保护检测策略操作简单、不受DNA序列编码的限制,与DNA信号放大检测策略相结合,可使得末端标记有与蛋白质结合的小分子的DNA链成为检测这些蛋白质的理想选择。富G碱基的DNA序列可以在Na+、K+、小分子或某些阳离子染料的诱导下折叠成高度有序的G-四链体或G-三链体结构,可以与荧光染料如硫黄素T（Th T）结合发出增强的荧光信号,在构建荧光生物传感器方面有着极其广泛的应用。Y型三向结构由于其结构简单、稳定性高等优异的性能,还能方便地用于与目标DNA的特异性识别,因此在许多信号放大领域具有巨大的应用潜力。本论文主要利用G-四链体、G-三链体与荧光染料Th T结合所发出光谱的特性以及Exo III辅助下基于Y型三向结构的DNA...
【文章来源】：湘潭大学湖南省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
无标记通用荧光生物传感器来检测目标DNA和凝血酶
第1章绪论3过程，具有简单、经济等优点。该实验在对凝血酶与其类似物做的选择性实验中得到了令人满意的结果，且在实际样品（血清）中的加标回收实验表明该生物传感器平台可用于实际样品检测。图1-2新型无标记比率荧光探针的可视生物传感器来检测过氧化氢和氧化酶JieqiongChen等[36]基于GelRed/[G3T]5/Tb3+杂化构建了一个新型无标记比率荧光探针的可视生物传感器平台来对过氧化氢和氧化酶进行检测。其原理描绘如图1-2所示，首先设计了GelRed/[G3T]5/Tb3+杂化是由凝胶红GelRed和单链DNA[G3T]5和Tb3+构成，然后用Hg2+和半胱氨酸(Cys)调节。其中凝胶红是广泛用作凝胶电泳核酸插层染色的敏感染料[37]，游离凝胶呈弱荧光；作为绿色荧光材料的镧系离子Tb3+与鸟嘌呤的三重态能量共振能级堆叠，可以大大增强Tb3+的发射[38]，因此Tb3+的荧光强度在[G3T]5存在下显著增强，呈增强的绿色荧光。当凝胶化的[G3T]5和Tb3+溶液混合在一起时，它将显示绿色荧光。加入Hg2+，Hg2+可与胸腺嘧啶(T)碱基特异性互相作用，构成强而稳固的T-Hg2+-T复合物[39]，[G3T]5/Tb3+中Tb3+的敏化荧光被有效猝灭，而凝胶[G3T]5的荧光稳定，因此混合物呈现红色荧光；在上述体系中进一步添加Cys后，Hg2+从T-Hg2+-T络合物中被捕捉，然后打开[G3T]5/Tb3+的荧光，因此混合物再次呈现绿色。该传感器机理是基于过氧化氢与Cys之间的特异性反应，由此产生的二硫化物逆转了Cys介导的[G3T]5/Tb3+的荧光变化，因此加入目标物过氧化氢后混合物呈现红色荧光。由于葡萄糖氧化酶(GOx)生物催化氧化葡萄糖和乙酰胆碱酯酶/胆碱氧化酶(AChE/ChOx)级联反应生成过氧化氢，因此该传感器平台可进一步应用于氧化酶相关反应的监测。此外，该实验还证明了它在仅使用手
第1章绪论41.2小分子DNA末端保护策略研究蛋白质与小分子的相互作用在化学、生物学与医学中均有重要意义[40]。随着对小分子和蛋白质之间相互作用的深化探讨，当小分子部分与其蛋白质目标结合时，末端与小分子相连的单链DNA(ssDNA)因受到保护而不被核酸外切酶I(ExoI)、核酸外切酶III(ExoIII)或Okenokoites黄杆菌限制性内切酶(FokI)所水解消化[41,42]，通过这种反应，蛋白质检测可以转化为DNA检测[43]。基于引人注目的“小分子DNA的末端保护”的检测策略操作简单，不受DNA序列编码的限制，方便与DNA信号放大检测策略相结合，因此末端标记有与蛋白质结合的小分子的DNA链可能是检测这些蛋白质的理想选择[44]。近年来，小分子DNA末端保护策略被广泛应用于各种生物分子的检测，如DNA甲基转移酶(Dnmt1)和糖基化酶(hogg1)[45]、链霉亲和素(SA)[46,47]、叶酸受体(FR)[48]、转录因子(TF)[49,50]、核因子kappaB(NF-κB)[51]和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)[52]等。图1-3基于SA-生物素相互作用的荧光生物传感器来检测SAYueHe等[53]构建了一个基于以聚（胸腺嘧啶）(polyT)为模板的铜纳米粒(CuNPs)与ExoIII辅助的DNA循环扩增策略、通过SA-生物素的相互作用来检测SA。实验原理如图1-3所示，首先设计了一个未标记的茎环DNA，茎环DNA包含两个结构域，它们根据功能的不同分别被定义为I和II。区域I（红色）是富含胸腺嘧啶的序列(T30)，它可以有效模板化地形成荧光探针CuNPs，区域II（蓝色）是触发链DNA的识别域。在茎环DNA中，区域I(T30)通过与区域II
本文编号：3575259
【文章来源】：湘潭大学湖南省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
无标记通用荧光生物传感器来检测目标DNA和凝血酶
第1章绪论3过程，具有简单、经济等优点。该实验在对凝血酶与其类似物做的选择性实验中得到了令人满意的结果，且在实际样品（血清）中的加标回收实验表明该生物传感器平台可用于实际样品检测。图1-2新型无标记比率荧光探针的可视生物传感器来检测过氧化氢和氧化酶JieqiongChen等[36]基于GelRed/[G3T]5/Tb3+杂化构建了一个新型无标记比率荧光探针的可视生物传感器平台来对过氧化氢和氧化酶进行检测。其原理描绘如图1-2所示，首先设计了GelRed/[G3T]5/Tb3+杂化是由凝胶红GelRed和单链DNA[G3T]5和Tb3+构成，然后用Hg2+和半胱氨酸(Cys)调节。其中凝胶红是广泛用作凝胶电泳核酸插层染色的敏感染料[37]，游离凝胶呈弱荧光；作为绿色荧光材料的镧系离子Tb3+与鸟嘌呤的三重态能量共振能级堆叠，可以大大增强Tb3+的发射[38]，因此Tb3+的荧光强度在[G3T]5存在下显著增强，呈增强的绿色荧光。当凝胶化的[G3T]5和Tb3+溶液混合在一起时，它将显示绿色荧光。加入Hg2+，Hg2+可与胸腺嘧啶(T)碱基特异性互相作用，构成强而稳固的T-Hg2+-T复合物[39]，[G3T]5/Tb3+中Tb3+的敏化荧光被有效猝灭，而凝胶[G3T]5的荧光稳定，因此混合物呈现红色荧光；在上述体系中进一步添加Cys后，Hg2+从T-Hg2+-T络合物中被捕捉，然后打开[G3T]5/Tb3+的荧光，因此混合物再次呈现绿色。该传感器机理是基于过氧化氢与Cys之间的特异性反应，由此产生的二硫化物逆转了Cys介导的[G3T]5/Tb3+的荧光变化，因此加入目标物过氧化氢后混合物呈现红色荧光。由于葡萄糖氧化酶(GOx)生物催化氧化葡萄糖和乙酰胆碱酯酶/胆碱氧化酶(AChE/ChOx)级联反应生成过氧化氢，因此该传感器平台可进一步应用于氧化酶相关反应的监测。此外，该实验还证明了它在仅使用手
第1章绪论41.2小分子DNA末端保护策略研究蛋白质与小分子的相互作用在化学、生物学与医学中均有重要意义[40]。随着对小分子和蛋白质之间相互作用的深化探讨，当小分子部分与其蛋白质目标结合时，末端与小分子相连的单链DNA(ssDNA)因受到保护而不被核酸外切酶I(ExoI)、核酸外切酶III(ExoIII)或Okenokoites黄杆菌限制性内切酶(FokI)所水解消化[41,42]，通过这种反应，蛋白质检测可以转化为DNA检测[43]。基于引人注目的“小分子DNA的末端保护”的检测策略操作简单，不受DNA序列编码的限制，方便与DNA信号放大检测策略相结合，因此末端标记有与蛋白质结合的小分子的DNA链可能是检测这些蛋白质的理想选择[44]。近年来，小分子DNA末端保护策略被广泛应用于各种生物分子的检测，如DNA甲基转移酶(Dnmt1)和糖基化酶(hogg1)[45]、链霉亲和素(SA)[46,47]、叶酸受体(FR)[48]、转录因子(TF)[49,50]、核因子kappaB(NF-κB)[51]和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)[52]等。图1-3基于SA-生物素相互作用的荧光生物传感器来检测SAYueHe等[53]构建了一个基于以聚（胸腺嘧啶）(polyT)为模板的铜纳米粒(CuNPs)与ExoIII辅助的DNA循环扩增策略、通过SA-生物素的相互作用来检测SA。实验原理如图1-3所示，首先设计了一个未标记的茎环DNA，茎环DNA包含两个结构域，它们根据功能的不同分别被定义为I和II。区域I（红色）是富含胸腺嘧啶的序列(T30)，它可以有效模板化地形成荧光探针CuNPs，区域II（蓝色）是触发链DNA的识别域。在茎环DNA中，区域I(T30)通过与区域II
本文编号：3575259
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