生物催化立体选择性MBH反应的研究
发布时间：2022-09-17 20:36
森田-贝利斯-希尔曼反应（MBH反应）是重要的碳-碳键形成反应,在过去的几十年中,MBH产物已经引起了人们的广泛关注,它可以作为含有烯基丙醇的复杂天然产物的有价值的组成部分。在传统的化学催化中存在环境污染,反应条件复杂等问题。目前关于酶催化MBH反应的报道普遍存在催化效率不高的情况。本文使用酯酶、丙氨酸消旋酶、烯键还原酶催化MBH反应。我们主要以硝基苯甲醛和环己烯酮为底物,磷酸缓冲液为溶剂的条件下催化MBH反应。经过对三种酶催化的几个重要的参数进行优化,发现ER具有较好的催化效果。随后引入添加剂辅助ER催化MBH反应,并制备ER突变体期望进一步提高酶的催化效果。我们对酯酶和丙氨酸消旋酶进行克隆表达和蛋白纯化。从枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis168）基因组中获得酯酶yitV、丙氨酸消旋酶基因alr1,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达相应蛋白。yitV最佳诱导温度为16℃,IPTG终浓度0.01 mM,alr1最佳诱导温度为25℃,IPTG终浓度0.1 mM。蛋白经过镍柱纯化后得到纯的alr1、yitV。将构建成功的yitV、alr1和ER用于催化MBH反应中...
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 酶源的广泛性
1.2 酶催化的非专一性反应
1.2.1 烯键还原酶催化的非专一性反应
1.2.2 酯酶催化的非专一性反应
1.2.3 其它种类的酶催化的非专一性反应
1.3 酶催化非专一性反应的重要性
1.3.1 酶催化非专一性反应的发展
1.3.2 酶催化非专一性反应的意义
1.4 MBH反应的研究
1.4.1 MBH反应的机理
1.4.2 化学催化MBH反应的研究
1.4.3 生物催化MBH反应
1.5 本论文的研究思想
第二章 催化MBH反应的酶源筛选
2.1 引言
2.2 实验材料和仪器
2.2.1 菌种与质粒
2.2.2 主要试剂
2.2.3 实验仪器
2.2.4 引物设计及酶切位点
2.3 实验方法
2.3.1 试剂的配置
2.3.2 酶的获取及克隆
2.3.3 酶的表达
2.3.4 酶的纯化
2.3.5 酶催化MBH反应
2.3.6 反应转化率及立体选择性的检测方法
2.4 结果与讨论
2.4.1 酶的克隆
2.4.2 酶的诱导表达
2.4.3 酶的纯化
2.4.4 酶催化MBH反应的建立
2.4.5 ER催化MBH反应条件的优化
2.4.6 alr1 催化MBH反应条件的优化
2.4.7 yitV催化MBH反应条件的优化
2.4.8 多种酶催化MBH反应
2.5 小结
第三章 烯键还原酶催化MBH反应
3.1 引言
3.2 实验材料和仪器
3.2.1 菌种
3.2.2 主要试剂和实验仪器
3.2.3 引物设计
3.3 实验方法
3.3.1 ER突变体的获取与克隆
3.3.2 ER突变体的表达
3.3.3 ER突变体的纯化
3.3.4 ER突变体催化MBH反应
3.4 结果与讨论
3.4.1 ER突变体基因的获取
3.4.2 ER突变体与载体形成的重组质粒鉴定及表达
3.4.3 添加剂对ER催化MBH反应的影响
3.4.4 ER突变体催化MBH反应
3.4.5 分子模拟
3.5 小结
第四章 氨基酸催化MBH反应
4.1 引言
4.2 实验试剂与器材
4.2.1 主要试剂和实验器材
4.3 实验方法
4.3.1 氨基酸催化MBH反应
4.4 结果与讨论
4.4.1 单个氨基酸的筛选
4.4.2 Pro催化MBH反应
4.4.3 氨基酸共催化MBH反应
4.4.4 酶和氨基酸共催化MBH反应
4.5 小结
第五章 结论
参考文献
附录
在学期间的科研成果
致谢
【参考文献】：
硕士论文
[1]蛋白酶催化不对称MBH反应、不对称Michael反应及Friedel-Crafts反应的研究[D]. 薛靖文.西南大学 2016
本文编号：3679902
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 酶源的广泛性
1.2 酶催化的非专一性反应
1.2.1 烯键还原酶催化的非专一性反应
1.2.2 酯酶催化的非专一性反应
1.2.3 其它种类的酶催化的非专一性反应
1.3 酶催化非专一性反应的重要性
1.3.1 酶催化非专一性反应的发展
1.3.2 酶催化非专一性反应的意义
1.4 MBH反应的研究
1.4.1 MBH反应的机理
1.4.2 化学催化MBH反应的研究
1.4.3 生物催化MBH反应
1.5 本论文的研究思想
第二章 催化MBH反应的酶源筛选
2.1 引言
2.2 实验材料和仪器
2.2.1 菌种与质粒
2.2.2 主要试剂
2.2.3 实验仪器
2.2.4 引物设计及酶切位点
2.3 实验方法
2.3.1 试剂的配置
2.3.2 酶的获取及克隆
2.3.3 酶的表达
2.3.4 酶的纯化
2.3.5 酶催化MBH反应
2.3.6 反应转化率及立体选择性的检测方法
2.4 结果与讨论
2.4.1 酶的克隆
2.4.2 酶的诱导表达
2.4.3 酶的纯化
2.4.4 酶催化MBH反应的建立
2.4.5 ER催化MBH反应条件的优化
2.4.6 alr1 催化MBH反应条件的优化
2.4.7 yitV催化MBH反应条件的优化
2.4.8 多种酶催化MBH反应
2.5 小结
第三章 烯键还原酶催化MBH反应
3.1 引言
3.2 实验材料和仪器
3.2.1 菌种
3.2.2 主要试剂和实验仪器
3.2.3 引物设计
3.3 实验方法
3.3.1 ER突变体的获取与克隆
3.3.2 ER突变体的表达
3.3.3 ER突变体的纯化
3.3.4 ER突变体催化MBH反应
3.4 结果与讨论
3.4.1 ER突变体基因的获取
3.4.2 ER突变体与载体形成的重组质粒鉴定及表达
3.4.3 添加剂对ER催化MBH反应的影响
3.4.4 ER突变体催化MBH反应
3.4.5 分子模拟
3.5 小结
第四章 氨基酸催化MBH反应
4.1 引言
4.2 实验试剂与器材
4.2.1 主要试剂和实验器材
4.3 实验方法
4.3.1 氨基酸催化MBH反应
4.4 结果与讨论
4.4.1 单个氨基酸的筛选
4.4.2 Pro催化MBH反应
4.4.3 氨基酸共催化MBH反应
4.4.4 酶和氨基酸共催化MBH反应
4.5 小结
第五章 结论
参考文献
附录
在学期间的科研成果
致谢
【参考文献】：
硕士论文
[1]蛋白酶催化不对称MBH反应、不对称Michael反应及Friedel-Crafts反应的研究[D]. 薛靖文.西南大学 2016
本文编号：3679902
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/huaxue/3679902.html
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