小分子荧光探针在超分辨成像中的应用

发布时间：2023-06-01 01:15

　　细胞膜作为细胞与外界的屏障,在维持细胞的稳定、物质运输、信号转导等过程中发挥着非常重要的作用。细胞膜结构和膜组成分子的异常化是许多疾病发生的关键因素。因此,解析细胞膜表面分子的分布及组装机理对于理解其生理功能及病理过程至关重要。为了在亚细胞结构内实现对生物分子分布的认知,直接观测是最有效便捷的方法。然而,这些分子的尺寸大多数在衍射极限以下,普通光学显微镜不能满足要求。近年来发展的超分辨荧光显微技术突破了光学衍射极限,在研究细胞膜分布、解析生物结构、揭示分子相互作用等方面做出了巨大贡献。其中,直接随机光学重构显微镜(direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,dSTORM)由于较高的分辨率和便捷的操作而得到广泛应用。dSTORM技术基于单个荧光分子的定位,需要成千上万张原始图片来重构一张超分辨图像,因此,超分辨图像的质量与获得的定位点密度和定位精度密切相关。为了获得更准确的超分辨图像,需要探针的精确定位和高密度识别。理想的探针应该是小尺寸、单价态、高特异性以及对靶标较小的干扰。传统的探针,例如抗体,尺寸相对较大且为多价态,在识别...

【文章页数】：155 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 文献综述
    1.1 超分辨荧光成像技术
        1.1.1 普通光学显微镜的分辨极限
        1.1.2 常见超分辨成像技术的类型
        1.1.3 超分辨显微镜的应用及发展
    1.2 常规超分辨成像的荧光探针
        1.2.1 荧光蛋白
        1.2.2 荧光染料
    1.3 新型小分子荧光标记探针
        1.3.1 基因表达探针
        1.3.2 非基因表达探针
        1.3.3 有机合成探针
    1.4 小分子荧光标记在超分辨成像中的应用
        1.4.1 生物正交反应
        1.4.2 活细胞超分辨成像
        1.4.3 单分子示踪
    1.5 本论文研究目的和意义
第2章 适配体标记用于细胞膜糖分子GalNAc的超分辨成像
    2.1 引言
    2.2 实验部分
        2.2.1 细胞培养
        2.2.2 玻片清洗
        2.2.3 凝集素连接荧光染料
        2.2.4 适配体染色
        2.2.5 超分辨样品的制备
        2.2.6 超分辨成像
        2.2.7 定位精度的测量
        2.2.8 SR-Tesseler簇分析方法
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 适配体标记用于GalNAc的超分辨成像
        2.3.2 适配体探针与凝集素探针的定位精度
        2.3.3 SR-Tesseler方法分析GalNAc在细胞膜上形成的簇
        2.3.4 适配体探针的特异性
    2.4 本章小结
第3章 适配体标记用于研究癌症相关分子globo H的分布特征
    3.1 引言
    3.2 实验部分
        3.2.1 细胞培养
        3.2.2 凝集素与染料的连接
        3.2.3 适配体标记
        3.2.4 超分辨样品的制备
        3.2.5 超分辨成像
        3.2.6 Hopkins统计的随机性检验
        3.2.7 基于坐标的共定位分析
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 适配体标记的globo H在MCF-7细胞膜上的超分辨成像
        3.3.2 定量分析globo H形成的簇
        3.3.3 Globo H在癌细胞和非癌细胞上的分布
        3.3.4 Globo H与其他癌症相关糖分子的分布关系
    3.4 本章小结
第4章 小分子肽标记用于研究细胞膜EpCAM蛋白的组装机理
    4.1 引言
    4.2 实验部分
        4.2.1 细胞培养
        4.2.2 质粒构建与转染
        4.2.3 siRNA敲除CD9
        4.2.4 抗体和小分子肽标记
        4.2.5 超分辨样品的制备
        4.2.6 超分辨成像
        4.2.7 图像重构
        4.2.8 FRC分辨率测量
        4.2.9 SR-Tesseler簇分析
        4.2.10 簇到簇距离的测量
        4.2.11 对相关函数分析
        4.2.12 CBC共定位分析
        4.2.13 互相关函数共定位分析
        4.2.14 基于镶嵌的共定位分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 小分子肽标记用于EpCAM超分辨成像
        4.3.2 定量分析EpCAM蛋白簇
        4.3.3 EpCAM蛋白簇部分共定位于四跨膜蛋白CD9微区
        4.3.4 肌动蛋白骨架与糖基化影响EpCAM蛋白的聚集
    4.4 本章小结
第5章 适配体AS1411用于核仁素的超分辨成像
    5.1 引言
    5.2 实验部分
        5.2.1 细胞培养
        5.2.2 抗体与染料的连接
        5.2.3 适配体标记
        5.2.4 抗体标记
        5.2.5 超分辨样品的制备
        5.2.6 超分辨成像
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 适配体AS1411用于超分辨成像
        5.3.2 不同细胞组分NCL分布的差异
        5.3.3 癌细胞和正常细胞NCL分布的比较
    5.4 本章小结
第6章 抑制剂探针用于研究PSMA在细胞膜上的分布模式
    6.1 引言
    6.2 实验部分
        6.2.1 细胞培养
        6.2.2 染料与抗体连接
        6.2.3 样品制备
        6.2.4 超分辨成像
        6.2.5 图像重构
        6.2.6 共定位分析
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 抑制剂探针用于PSMA的超分辨成像
        6.3.2 抑制剂探针与抗体探针标记的比较
        6.3.3 定量分析PSMA簇
        6.3.4 PSMA簇与叶酸受体(FR)共定位关系
    6.4 本章小结
第7章 论文总结
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果



本文编号：3826369