无膜细胞器中生物大分子稳定性、动力学和结构的NMR研究

发布时间：2024-04-23 20:38

　　无膜细胞器是细胞内具有液体性质的蛋白质和核酸的聚集体。这些亚细胞内区室是蛋白或者核酸通过液-液相分离的方式聚集在一起形成的。蛋白相分离参与了细胞众多重要的生理过程而受到广泛的关注。研究发现,相分离涉及到的细胞内活动有无膜细胞器的形成、超分子组装、信号转导、基因激活、细胞骨架等。另外,相分离现象与某些疾病如神经退行性疾病的发生密切相关。目前关于相分离现象的研究方法主要集中在分子生物学、体外重组和显微成像技术等,利用核磁共振方法研究蛋白质相分离的报道还比较少。有文献报道,ATP依赖的RNA解旋酶DDX4可以在体外和细胞内发生相分离形成小液滴,并且温度和盐浓度等外界条件可以调控DDX4的相分离。DDX4由236个氨基酸残基组成的无序N末端(DDX4N1)可以在溶液中发生相分离形成直径微米级别的小液滴,并且这些小液滴可以行使“过滤器”或者“浓缩器”的功能,选择性地招募某些生物大分子到这些小液滴中。研究发现,DDX4N1相分离时可以招募单链的核酸,并且使单链的核酸稳定,但是排斥双链的核酸;对蛋白质而言,这些小液滴呈现出范围很广的吸收或者排斥能力,并且那些能够被招募的蛋白能够充当载体运输不能进入的...

【文章页数】：95 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 蛋白质的液-液相分离
        1.1.1 细胞内的无膜细胞器
        1.1.2 细胞内相分离的重要性
        1.1.3 相分离机制的研究
        1.1.4 DDX4的相分离研究
        1.1.5 核磁共振方法在相分离研究中的应用
    1.2 核磁共振波谱学
        1.2.1 核磁共振的基本原理
        1.2.2 核磁共振的检测参数
        1.2.3 ¹⁹F NMR
        1.2.4 ¹H-¹⁵N HSQC
        1.2.5 NOESY实验和EXSY(化学交换)实验
        1.2.6 T1、T2的测定
    1.3 小结
2 DDX4N1和SH3的表达与纯化
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 DDX4N1和SH3表达载体的构建
        2.2.3 DDX4N1与SH3的表达
        2.2.4 DDX4N1与SH3的纯化
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 DDX4N1表达情况分析
        2.3.2 DDX4N1第一次Ni柱亲和层析结果
        2.3.3 脱盐柱层析置换酶切Buffer结果
        2.3.4 酶切和第二次Ni柱亲和层析结果
        2.3.5 脱盐柱层析结果
        2.3.6 SH3过QFF离子交换层析结果
        2.3.7 SH3凝胶过滤层析结果
        2.3.8 SH3脱盐柱层析结果
    2.4 小结
3 DDX4N1相分离及其结构的研究
    3.1 前言
    3.2 实验与方法
        3.2.1 DDX4N1的表达与纯化
        3.2.2 DDX4N1相分离条件的摸索
        3.2.3 DDX4N1的相分离效率
        3.2.4 DDX4N1的核磁共振实验
        3.2.5 DDX4N1圆二色谱(CD)实验
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 DDX4N1的最佳相分离条件及其相分离效率
        3.3.2 DDX4N1相分离结构的改变
    3.4 小结
4 DDX4N1相分离时包裹SH3和G-四链体的研究
    4.1 前言
    4.2 实验与方法
        4.2.1 蛋白样品的制备
        4.2.2 G-四链体的准备
        4.2.3 FITC标记SH3和DDX4N1
        4.2.4 DDX4N1相分离形成的droplets包裹SH3与G-四链体的观察
        4.2.5 SH3和G-四链体对DDX4N1相分离作用观察
        4.2.6 DDX4N1相分离形成的droplets包裹SH3浓度的测定
        4.2.7 DDX4N1相分离形成的droplets包裹SH3核磁样品的制备
        4.2.8 SH3在Ficoll 70溶液中核磁样品的制备
        4.2.9 核磁共振实验
        4.2.10 SH3热力学参数的拟合
    4.3 结果讨论
        4.3.1 DDX4N1相分离包裹SH3和G-四链体的观察
        4.3.2 SH3和G-四链体对DDX4N1相分离的作用
        4.3.3 SH3在DDX4N1相分离形成的droplet中浓度的测定
        4.3.4 DDX4N1与SH3和G-四链体的相互作用
        4.3.5 DDX4N1相分离时液液相包裹SH3
        4.3.6 SH3在DDX4N1 condensate中的动力学参数
    4.4 小结
5 总结和展望
    5.1 总结
    5.2 展望
参考文献
附录
致谢
作者简介及攻读期间发表的学术成果



本文编号：3962730