免疫磁珠—实时荧光PCR联用技术快速检测食品中单增李斯特菌的研究

发布时间：2017-06-10 14:07

  本文关键词：免疫磁珠—实时荧光PCR联用技术快速检测食品中单增李斯特菌的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：食品安全是食品中有毒有害物质对于人体健康影响的重大公共卫生问题。食源性致病菌是引起食品安全的最主要的来源。其中单增李斯特菌是一种极其常见的致病菌,可引起脑炎、脑膜炎、败血症、脓肿及孕妇流产等一系列食源性李斯特菌病,病死率较高,可达30%-70%。目前传统的细菌培养方法存在费时耗力等缺点,常规PCR方法有前处理时间长、易污染实验室环境等缺点。因此,建立食品中单增李斯特菌的快速、准确、可靠的检测方法具有非常重要的实际意义和应用价值。 本研究应用免疫磁珠分离技术,从污染菌很少的样品中快速富集单增李斯特菌,以集菌方法代替增菌培养,结合实时荧光PCR检测,提高单增李斯特菌的检出率,缩短检验时间,提高检测效率。 本实验通过比较EDC/NHS浓度、活化时间、抗体浓度、偶联时间和偶联温度等条件对免疫磁珠捕获单增李斯特菌效率的影响,确定免疫磁珠制备的具体流程：将磁珠用PBST (pH=6.0)清洗,加入475μLPBST (pH=7.4)和25μL1mg/mL抗体,室温下孵育2h后,分离,并封闭。再通过比较检测过程中免疫磁珠用量、富集时间和洗涤液pH,确定最佳条件：将100μ L的免疫磁珠加至100μ L的菌液中,在28℃、180rpm恒温摇床中孵育1h后,置于磁力架上进行分离,弃去上清液,用500μL PBS(pH=7.4)重复洗涤3次,最后用50μL PBS (pH=7.4)重悬,用于下一步实验。将免疫磁珠富集分离的单增李斯特菌提取DNA模板后,用实时荧光PCR检测,检测条件经优化后选择：PCR反应体系：Premix Taq:12.5μL, ROX reference Dye:0.5μL,上游引物(10pmol/mL):1μL,下游引物(10pmol/mL):1μL, Taqman探针(10pmol/mL):1μL,双蒸水：4μ L,DNA模板：5μ L,总体积为25μ L。PCR温度设置：第一阶段：95℃,2min;第二阶段：95℃,5s,60℃,35s,进行40个循环。 本方法可以实现102～106CFU/mL检测范围内线性相关度良好,最低检测限为80CFU/mL。应用于四大类九种食品：水产(海鱼、虾仁),肉类(生猪肉、香肠),蔬菜(生菜、黄瓜、番茄),奶类(牛奶、奶酪),实验结果表明IMBS-real time PCR法可以快速实现定量检测,且特异性和灵敏性较高,与传统培养方法相比,可以有效缩短检测周期,提高检测效率。
【关键词】：食品安全 单增李斯特菌 免疫磁珠 实时荧光 PCR
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：O657.3;TS201.6
【目录】：

• 致谢7-8
• 摘要8-9
• ABSTRACT9-11
• 目录11-14
• 插图和附表清单14-15
• 第一章 绪论15-31
• 1.1 研究背景15-25
• 1.1.1 食品安全问题现状15-17
• 1.1.2 单增李斯特菌在食品中的存在现状17-18
• 1.1.3 食源性致病菌的检测技术18-21
• 1.1.4 实时荧光PCR原理及其优点21-22
• 1.1.5 样品前处理22-23
• 1.1.6 免疫磁珠分离技术及其原理23-25
• 1.2 研究现状25-27
• 1.2.1 国外对病原微生物检测的研究现状25-26
• 1.2.2 国内对病原微生物检测的研究现状26-27
• 1.3 研究目的与意义27-28
• 1.4 主要研究内容及方法28-29
• 1.4.1 主要研究内容28
• 1.4.2 技术路线图28-29
• 1.5 本论文的组织架构29-30
• 1.6 本章小结30-31
• 第二章 实验材料与方法31-39
• 2.1 实验材料31-32
• 2.1.1 菌种31
• 2.1.2 试剂31
• 2.1.3 实际样品31
• 2.1.4 主要溶液配制31-32
• 2.1.5 主要仪器与设备32
• 2.2 实验方法32-38
• 2.2.1 免疫磁珠的制备32-35
• 2.2.1.1 磁珠活化33
• 2.2.1.1.1 EDC/NHS浓度33
• 2.2.1.1.2 EDC/NHS活化时间33
• 2.2.1.2 抗体偶联33-34
• 2.2.1.2.1 最佳抗体浓度的选择34
• 2.2.1.2.2 最佳偶联时间的选择34
• 2.2.1.2.3 最佳偶联温度的选择34
• 2.2.1.3 封闭与保存34-35
• 2.2.2 免疫磁珠捕捉单增李斯特菌的方法建立及条件优化35-36
• 2.2.2.1 最佳用量35
• 2.2.2.2 最佳富集时间35
• 2.2.2.3 洗涤液的最佳pH值35-36
• 2.2.3 DNA模板的提取36
• 2.2.4 实时荧光PCR检测36-37
• 2.2.4.1 引物与探针的设计与合成36
• 2.2.4.2 引物浓度优化36
• 2.2.4.4 探针浓度优化36-37
• 2.2.4.5 延伸温度优化37
• 2.2.5 实际样品检测37
• 2.2.5.1 样品采集37
• 2.2.5.2 样品中单增李斯特菌富集与检测37
• 2.2.6 平板计数法37-38
• 2.3 本章小结38-39
• 第三章 免疫磁珠的制备与单增李斯特菌捕获39-48
• 3.1 抗体纯化39
• 3.2 免疫磁珠制备条件的优化39-44
• 3.2.1 EDC/NHS浓度优化39-40
• 3.2.2 EDC/NHS活化时间优化40-41
• 3.2.3 抗体浓度优化41-42
• 3.2.4 抗体偶联时间优化42-43
• 3.2.5 抗体偶联温度优化43-44
• 3.3 免疫磁珠捕获单增李斯特菌最佳条件的选择44-47
• 3.3.1 免疫磁珠最佳用量的探索44-45
• 3.3.2 免疫磁珠最佳富集时间的探索45-46
• 3.3.3 洗涤液最佳pH的探索46-47
• 3.4 本章小结47-48
• 第四章 实时荧光PCR检测方法建立48-54
• 4.1 DNA模板提取48
• 4.2 引物与探针设计48
• 4.3 实时荧光PCR条件优化48-51
• 4.3.1 引物浓度优化48-49
• 4.3.2 探针浓度优化49-50
• 4.3.3 延伸温度优化50-51
• 4.4 实时荧光PCR的特异性评价51
• 4.5 实时荧光PCR的灵敏性检测51-52
• 4.6 实时荧光PCR的重复性检测52-53
• 4.7 本章小结53-54
• 第五章 IMBS-real time PCR法检测食品中的单增李斯特菌54-61
• 5.1 样品前处理54
• 5.1.1 样品采集54
• 5.1.2 人工染菌54
• 5.2 免疫磁珠富集分离54-55
• 5.3 实时荧光PCR法检测55
• 5.4 联用技术效果评价55-60
• 5.4.1 食品中单增李斯特菌捕捉效率分析55-57
• 5.4.2 IMBS-real time PCR法的抗干扰性能评价57-58
• 5.4.3 IMBS-real time PCR法的稳定性分析58
• 5.4.4 样品定量检测58-59
• 5.4.5 市售食品中单增李斯特菌的污染情况59
• 5.4.6 与国内同类方法的比较59-60
• 5.5 本章小结60-61
• 第六章 总结与展望61-62
• 6.1 论文总结61
• 6.2 展望61-62
• 参考文献62-68
• 作者筒介及硕士期间的主要科研成果68

【参考文献】

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本文编号：438736