用于拟干酪乳杆菌代谢组学分析的样品处理方法研究和应用

发布时间：2017-06-12 10:04

  本文关键词：用于拟干酪乳杆菌代谢组学分析的样品处理方法研究和应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：用气相色谱-质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS)技术建立了用于检测拟干酪乳杆菌胞内代谢物的代谢组学研究方法。考察了不同溶解剂(吡啶、四氢呋喃、甲氧胺盐酸盐)和衍生化试剂(N-甲基叔丁基二甲基硅基三氟乙酰胺、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰+三甲基氯硅烷和N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺),对质谱峰的信号强度和个数的影响,确定使用吡啶作为溶解剂、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰+三甲基氯硅烷作为衍生剂的两步衍生法效果最佳。以拟干酪乳杆菌为分析对象,共鉴定出49种胞内中间代谢物。方法学考察结果表明,该方法具有良好的精密度、稳定性和重现性。此外,还采用主成分分析方法对所获得的拟干酪乳杆菌发酵过程胞内代谢产物变化数据进行了代谢模式识别研究。 本文建立了一个用于拟干酪乳杆菌代谢组学研究的样品灭活和萃取方法。使用单元和多元数据分析方法,分析了不同灭活方法(60%甲醇、60%甲醇/0.9%碳酸铵(pH6.0)、60%甲醇/0.9%氯化钠、40%乙醇/0.9%氯化钠和60%甘油/1.35%氯化钠)和萃取方法(100%甲醇,70%甲醇,甲醇/氯仿,乙腈/甲醇/水,连续萃取)作用效果。研究结果表明发现60%甲醇/0.9%氯化钠灭活效率最高并且能够有效降低胞内代谢物渗出,是最适合的灭活方法。此外,建立了连续萃取方法,先使用70%甲醇萃取然后再使用乙腈/甲醇/水萃取,此萃取方法的萃取效率最高且重复性好。 此外,本文将建立的GC-MS分析方法和代谢组学研究的样品处理方法成功用于分析拟干酪乳杆菌发酵生产乳酸过程中的代谢变化。乳酸发酵过程随着发酵进行,菌体进入稳定期后,溶氧往往出现回升现象,同时乳酸产率和得率都有一定程度的下降。采集溶氧(Dissolved Oxygen, DO)回升前后发酵样品进行代谢物组分析,并采用主成分分析法(Principal Component Analysis, PCA)对所获得的代谢物组数据进行模式识别。分析结果表明,发酵过程中伴随着DO回升,大多数胞内代谢物浓度随时间变化发生显著性差异,主要是EMP途径和TCA循环中间代谢物出现大量积累,拟干酪乳杆菌代谢轮廓也呈现出一定规律的变化。因此发酵代谢途径的迁移是造成DO回升后乳酸产率和得率下降的原因。
【关键词】：拟干酪乳杆菌 灭活方法 萃取方法 代谢组学 发酵
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：Q936;O658
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 前言10-21
• 1.1 乳酸的性质及其用途10
• 1.1.1 乳酸性质10
• 1.1.2 乳酸及其衍生物的用途10
• 1.2 代谢组学定义10-12
• 1.3 代谢组学的应用12-13
• 1.4 代谢组学的分析流程13-14
• 1.5 微生物代谢组学生物实验14-16
• 1.5.1 终止微生物代谢14-15
• 1.5.2 灭活剂灭活效率的判定15
• 1.5.3 萃取胞内代谢物15-16
• 1.6 代谢组学研究仪器分析技术16-19
• 1.6.1 核磁共振16
• 1.6.2 气相色谱-质谱联用仪16-18
• 1.6.3 液相色谱-质谱联用技术18
• 1.6.4 其他质谱技术18-19
• 1.7 定量拟干酪乳杆菌代谢组方法的目的和意义19-20
• 1.8 研究内容20-21
• 第2章 材料和方法21-27
• 2.1 实验材料21-25
• 2.1.1 菌种21
• 2.1.2 仪器21-22
• 2.1.3 试剂22-24
• 2.1.4 培养基配方24-25
• 2.1.5 培养方法25
• 2.2 分析和测定方法25-27
• 2.2.1 pH测定25-26
• 2.2.2 菌体密度测定26
• 2.2.3 发酵液中葡萄糖浓度的测定26
• 2.2.4 乳酸测定26
• 2.2.5 GC-MS分析方法26
• 2.2.6 细胞灭活方法和代谢物萃取方法26-27
• 第3章 GC-MS样品衍生方法建立27-36
• 3.1 引言27
• 3.2 实验方法27-28
• 3.2.1 GC-MS样品衍生方法27-28
• 3.2.2 色谱质谱条件28
• 3.2.3 代谢物鉴定28
• 3.3 实验结果与讨论28-35
• 3.3.1 不同溶解剂比较28-29
• 3.3.2 不同衍生剂比较29-32
• 3.3.3 一步衍生法和两步衍生法比较32
• 3.3.4 内标的选择32-33
• 3.3.5 代谢物谱分析与物质鉴定33
• 3.3.6 GC-MS分析方法学考察33-35
• 3.4 本章小结35-36
• 第4章 用于拟乳酪杆菌代谢组学研究的取样灭活和萃取方法研究36-51
• 4.1 引言36
• 4.2 实验方法36-38
• 4.2.1 灭活方法36
• 4.2.2 萃取方法36-37
• 4.2.3 灭活过程中代谢物渗出实验37
• 4.2.4 灭活效率37
• 4.2.5 胞内代谢物分析：GC-MS37
• 4.2.6 数据统计分析和可视化37-38
• 4.3 实验结果38-50
• 4.3.1 不同的灭活方法比较38-43
• 4.3.2 不同的萃取方法比较43-50
• 4.4 讨论50
• 4.5 本章小结50-51
• 第5章 拟干酪乳杆菌发酵生产乳酸过程代谢轮廓变化51-60
• 5.1 引言51-52
• 5.2 实验方法52
• 5.2.1 5L发酵罐培养52
• 5.3 实验结果52-58
• 5.3.1 拟干酪乳杆菌发酵过程菌体代谢特征52-55
• 5.3.2 拟干酪乳杆菌胞内代谢物变化55-58
• 5.4 讨论58-59
• 5.5 本章小结59-60
• 第6章 总结与展望60-62
• 6.1 实验总结60
• 6.2 展望60-62
• 参考文献62-68
• 致谢68

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