中药材污染真菌毒素的液质联用高通量检测研究

发布时间：2017-06-22 15:10

  本文关键词：中药材污染真菌毒素的液质联用高通量检测研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 建立一种适合中药材污染黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,赭曲霉毒素A和杂色曲霉毒素的液质联用(LC-MS/MS)高通量检测方法；并应用该方法检测收集自广州地区不同药店和医院药房的中药材,从而初步了解该地区的中药材污染以上6种真菌毒素的现状,为国家管理部门制定相关的限量标准提供参考。 方法： 以中药材苦杏仁和太子参为代表药材(分别代表果实种子类和根及根茎类中药材),通过优化高效液相的色谱条件(流动相和洗脱梯度)、三重四级杆质谱仪的参数和样品前处理方法(提取溶剂、定容溶剂的选择和稀释法的应用),以期提高整个检测系统对黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,赭曲霉毒素A和杂色曲霉毒素的灵敏度,克服由中药材复杂的化学成分所引起的基质效应,从而提高LC-MS/MS检测方法的准确度；进一步,本研究采用黄曲霉素专用商品多功能净化柱Mycosep226纯化样品提取液,并比较柱纯化方法与本研究建立的前处理方法在黄曲霉毒素B1,B2,G1和G2回收率上的差异,探讨Mycosep226净化柱用于中药材污染四种黄曲霉毒素检测的适用性；最后,本研究将建立的新方法拓展至薏苡仁、枸杞子等其它37种中药材和花生等3种食品的检测,分别考察这些样品在高、中、低三个浓度水平的基质效应,以评估该LC-MS/MS方法的可行性和适用性。 结果： 本研究最终确定的样品制备和检测方法为：取中药材粉末(过三号筛),加10mL84%乙腈(体积比)涡旋振荡提取70min后,取250μL的上清液在氮气下吹干,残渣加入1mL色谱甲醇复溶,最后经过0.22μm的有机微孔滤膜过滤,直接进样检测(10μL)；以C18色谱柱为固定相,4.0mmol/L醋酸铵-0.1%甲酸水溶液(水相)和甲醇(有机相)为流动相,采用梯度洗脱的方式,样品经色谱分离后注入三重四级杆质谱仪,在选择反应监测模式(SRM)下检测(ESI+)6种真菌毒素的峰面积,通过外标法计算相应的浓度。 经方法学验证,黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,赭曲霉毒素A和杂色曲霉毒素在各自的质量浓度范围内线性关系良好,r0.995,两种代表中药材在高、中、低3个浓度水平的绝对回收率为84.8%-110.6%,提取回收率为83.6～106.1%,定量限为1.6-25.0ng/L,精密度RSD9.9%,长期稳定性表明该检测系统在一个月内的稳定性良好,RSD9.8%；而对比实验的结果显示所建立的方法与使用Mycosep226净化柱纯化样品的方法相比,具有准确度更高、操作更简便和检测成本更低等优点。 在考察的39种中药材中,薏苡仁和党参等25种的基质效应80.2%-118.6%,该偏差与文献报道的允许范围一致,表明基质效应不会对这些中药材的准确定量造成影响,可忽略不计,并且相应药材样品的检测结果可采用外标法进行定量换算；而红枣和红参等其他14种中药材的考察结果显示,每种药材均有1或2个真菌毒素的基质效应小于80%或大于120%,表明中药材产生的基质效应会对这些真菌毒素的检测结果产生一定影响,该LC-MS/MS方法仍存在一定的局限性。 对收集自广州地区5家大型连锁型药店和5家三甲医院中药房的39种中药材共365份样品的LC-MS/MS检测结果显示,中药材污染杂色曲霉毒素的情况最严重(污染率23.8%),其次是黄曲霉毒素B1(7.9%)、赭曲霉毒素A(4.4%)和黄曲霉毒素B2(3.8%),最后是黄曲霉毒素G1(1.6%)和G2(0.3%)。 利用本论文的方法测得大米、花生和玉米三种食品的基质效应为82.1%-118.3%,表明该方法同样适用于这三种样品的高通量检测。对购买自广州地区5家超市共16份样品的检测结果发现,样品中污染最严重的真菌毒素是黄曲霉毒素B1(25.0%),其次是杂色曲霉毒素(18.8%)、黄曲霉毒素B2(12.5%)和G2(6.3%),但未见黄曲霉毒素G1和赭曲霉毒素A的污染。 结论： 本研究建立的LC-MS/MS方法具有预处理简便、经济等优点,样品无需经过净化柱纯化即可通过外标法进行准确的定量,从而适合用这39种中药材及3种食品污染6种真菌毒素的高通量检测。对采集白药店和医院药房的中药材样品的检测结果表明杂色曲霉毒素的污染情况是6种真菌毒素中最严重的,但此前并未见有相关的报道。考虑到杂色曲霉毒素是黄曲霉毒素B1在生物合成途径上的前体化合物,并且被世界卫生组织划定为2B致癌物,因此这一现状应当引起有关部门的重视,开展更广泛的调查和研究,以保证中药材的用药安全。
【关键词】：中药材 黄曲霉毒素 赭曲霉毒素A 杂色曲霉毒素 液质联用
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R284.1;O657.63
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 目录7-9
• 图目录9-10
• 表目录10-11
• 第一章 文献综述11-22
• 第一节 真菌毒素的简介及其限量标准11-15
• 一、黄曲霉毒素11-12
• 二、赭曲霉毒素A12
• 三、杂色曲霉毒素12-13
• 四、中药材污染真菌毒素现状分析13-14
• 五、真菌毒素的限量标准14-15
• 第二节 中药材污染真菌毒素检测方法的概述15-22
• 一、薄层色谱法15
• 二、气相色谱法15-16
• 三、高效液相色谱法16
• 四、液质联用法16-22
• 第二章 LC-MS/MS检测6种真菌毒素方法的优化及建立22-37
• 第一节 材料与方法22-24
• 一、仪器22
• 二、试剂与材料22
• 三、工作对照品溶液的配制22-23
• 四、中药材采集23
• 五、实验条件23-24
• 第二节 LC-MS/MS方法的优化24-28
• 一、质谱参数优化24-25
• 二、液相条件优化25-27
• 三、样品前处理方法的优化27-28
• 第三节 LC-MS/MS的方法学考察28-35
• 一、专属性试验28
• 二、标准曲线的建立28-29
• 三、检测限(LOD)及定量限(LOQ)29-31
• 四、日内、日间精密度试验31
• 五、重复性实验31
• 六、基质效应的考察31-32
• 七、回收率实验32
• 八、样品前处理方法的对比实验32-35
• 第四节 讨论35-36
• 一、LC-MS/MS方法的优化35
• 二、柱纯化方法的探讨35-36
• 第五节 小结36-37
• 第三章 LC-MS/MS方法高通量检测中药材污染的6种真菌毒素37-50
• 第一节 基质效应的考察37-41
• 一、中药材样品的采集37-38
• 二、基质效应的考察38-41
• 第二节 中药材样品的检测41-48
• 一、目标峰确认的依据41
• 二、样品的检测与分析41-48
• 第三节 讨论48-49
• 一、基质效应的考察48
• 二、中药材污染真菌毒素的现状分析48-49
• 第四节 小结49-50
• 第四章 LC-MS/MS方法拓展应用的研究50-53
• 一、样品采集50
• 二、基质效应考察50-51
• 三、样品的检测与分析51
• 四、讨论51-52
• 五、小结52-53
• 第五章 结论与展望53-55
• 第一节 结论53
• 第二节 展望53-55
• 一、基质效应的考察53-54
• 二、真菌毒素的检测54
• 三、真菌毒素检测结果的确证54
• 四、建立中药材污染真菌毒素的预警方法的必要性54-55
• 参考文献55-58
• 英文缩略语58-59
• 在校期间发表论文情况59-61
• 致谢61-62
• 资助项目62

【参考文献】

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本文编号：472206