重组腈水合酶NHaseK的功能表达及分子改造

发布时间：2017-07-18 18:01

  本文关键词：重组腈水合酶NHaseK的功能表达及分子改造

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【摘要】：腈水合酶(EC 4.2.1.84)可催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈(CPIN)水合生成相应的酰胺,用于合成高效杀虫剂氰戊菊酯的重要前体戊菊酸。但目前报道的可转化CPIN的腈水合酶数量较少且活性较低,极大地限制了催化效率。因此,对腈水合酶的重组表达及分子改造进行研究,改善其催化活性具有重要意义。本文以实验室前期获得的对CPIN有高活性的腈水合酶NHaseK为研究对象,构建了其在大肠杆菌中的功能表达体系。利用pETDuet-1具有双T7启动子的优势,将NHaseK功能表达必须具备的α亚基、β亚基和活化元件17k以八种不同的组合方式插入于两个启动子之下。当将三段基因以基因簇形式共同插入于第一个启动子之下时,亚基表达量均衡、活化元件充分表达,酶活表现最佳,比活为0.78 U/mg蛋白。进一步考察发现,不同质粒及SD序列对大肠杆菌表达NHaseK的影响不明显。考虑到p RSFDuet-1的卡那霉素抗性更适于发酵,确定以此为载体重组表达NHase K,粗酶活力为222.6 U/L。其次,采用同源建模和分子对接构建NHaseK-CPIN复合物构象,以此为基础改造NHaseK。一方面,通过虚拟丙氨酸扫描筛选出10个突变热点,根据它们的虚拟饱和突变结果选择αG119进行饱和突变实验,但效果不佳；根据它们的丙氨酸突变实验结果选择βD49和αQ88进行饱和突变,获得14株正向突变子,其中βD49G活性最高,其比活为2.48 U/mg蛋白,是原始酶NHaseK的3.2倍。另一方面,选择预测通道附近的大位阻残基βF41进行饱和突变,未能获得正向突变子。进一步对正向突变子进行组合突变,未能获得理想突变子。最后,考察βD49G及NHaseK的酶学性质并初步探索催化CPIN工艺。发现βD49G的Kat增大4.4倍,是其活性提升的主要原因。此外p49G热稳定性也都有所提升,其在35℃、40℃、45℃的半衰期分别为114h、76 h、25 h,较原始酶NHaseK分别延长39%、72%、56%。初步探索重组菌E.coli/pRSFDuet-βD49G及E.coli/pRSFDuet-NHaseK催化工艺,确定它们的最适转化条件均为40℃、pH6.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲体系、5%(v/v)甲醇作助溶剂。当βD49G以0759 gDCW/L的细胞用量催化0.5 g/L CPIN时,在1h内完成转化,其效率是NHaseK的2倍。
【关键词】：腈水合酶 CPIN 功能表达 半理性设计
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 缩写符号术语表12-13
• 第一章 综述13-27
• 1.1 腈水合酶13-21
• 1.1.1 腈水合酶的来源与种类13-14
• 1.1.2 腈水合酶的基因序列特征14-15
• 1.1.3 腈水合酶的结构特征15-16
• 1.1.4 腈水合酶的催化机理16-17
• 1.1.5 腈水合酶的重组表达及活化元件17-20
• 1.1.6 腈水合酶的应用20-21
• 1.2 氰戊菊酯21-23
• 1.2.1 氰戊菊酯的简介21-22
• 1.2.2 生物催化法制备氰戊菊酯前体戊菊酸22-23
• 1.3 酶的分子改造23-26
• 1.3.1 定向进化23-24
• 1.3.2 理性设计24
• 1.3.3 半理性设计24-26
• 1.4 本课题的研究思路与主要内容26-27
• 第二章 腈水合酶NHaseK在大肠杆菌中的功能表达27-49
• 2.1 引言27
• 2.2 材料与试剂27-29
• 2.2.1 实验仪器27
• 2.2.2 质粒与菌种27-28
• 2.2.3 药品与试剂28
• 2.2.4 溶液与培养基的配制28-29
• 2.3 实验方法29-36
• 2.3.1 质粒的提取29
• 2.3.2 目的基因片段的扩增29-31
• 2.3.3 重组质粒的构建31-32
• 2.3.4 重组质粒的转化和验证32
• 2.3.5 重组酶的诱导表达32
• 2.3.6 重组酶的纯化32-33
• 2.3.7 SDS-PAGE33
• 2.3.8 蛋白浓度的测定33-34
• 2.3.9 底物与产物浓度的测定34-35
• 2.3.10 酶活的定义与测量35-36
• 2.4 结果与讨论36-48
• 2.4.1 采用pETDuet-1实现NHaseK各亚基的平衡表达36-43
• 2.4.1.1 以pETDuet-1为载体的表达策略设计36-38
• 2.4.1.2 以pETDuet-1为载体的重组质粒的构建38-39
• 2.4.1.3 NHaseK以pETDuet-1为载体时的表达与活力39-42
• 2.4.1.4 重组酶的纯化与最佳表达策略的确定42-43
• 2.4.2 质粒拷贝数对表达NHaseK的影响43-45
• 2.4.2.1 以不同质粒为载体构建NHaseK的重组质粒43-44
• 2.4.2.2 NHaseK在不同质粒中的表达与活力44-45
• 2.4.3 SD序列对表达NHaseK的影响45-48
• 2.4.3.1 SD序列的设计45
• 2.4.3.2 优化NHaseK的SD序列45-47
• 2.4.3.3 SD优化重组质粒的表达47-48
• 2.5 本章小结48-49
• 第三章 腈水合酶NHaseK的半理性设计49-68
• 3.1 引言49
• 3.2 材料与试剂49-50
• 3.2.1 实验仪器49
• 3.2.2 质粒与菌株49
• 3.2.3 药品与试剂49-50
• 3.2.4 溶液与培养基的配制50
• 3.3 实验方法50-52
• 3.3.1 同源建模50
• 3.3.2 分子对接50
• 3.3.3 虚拟丙氨酸扫描50
• 3.3.4 虚拟定点饱和突变50
• 3.3.5 定点突变引物设计50-52
• 3.3.6 突变子的构建52
• 3.3.7 突变酶的表达与纯化52
• 3.3.8 突变酶的活力测定52
• 3.4 结果与讨论52-67
• 3.4.1 腈水合酶NHaseK的同源建模52-55
• 3.4.2 NHaseK与底物CPIN的分子对接55-56
• 3.4.3 基于虚拟丙氨酸扫描的半理性设计56-65
• 3.4.3.1 NHaseK的虚拟丙氨酸扫描56-57
• 3.4.3.2 结合虚拟饱和突变的半理性设计57-60
• 3.4.3.3 结合丙氨酸突变实验的半理性设计60-65
• 3.4.4 基于预测通道的半理性设计65-66
• 3.4.5 组合突变66-67
• 3.5 本章小结67-68
• 第四章 突变子βD49G与原始酶的酶学性质及催化工艺对比68-83
• 4.1 引言68
• 4.2 材料与试剂68-69
• 4.2.1 实验仪器68
• 4.2.2 质粒与菌种68
• 4.2.3 药品与试剂68-69
• 4.2.4 溶液与培养基的配制69
• 4.3 实验方法69-72
• 4.3.1 酶学性质研究69-70
• 4.3.1.1 温度对重组酶的影响69
• 4.3.1.2 pH对重组酶影响69-70
• 4.3.1.3 重组酶的动力学参数70
• 4.3.2 催化工艺研究70-71
• 4.3.2.1 温度对全细胞转化CPIN的影响70
• 4.3.2.2 pH对全细胞转化CPIN的影响70-71
• 4.3.2.3 助溶剂甲醇浓度对全细胞转化CPIN的影响71
• 4.3.2.4 细胞量对转化过程的影响71
• 4.3.3 细胞干重的测定71-72
• 4.4 结果与讨论72-81
• 4.4.1 βD49G与NHaseK的酶学性质对比72-77
• 4.4.1.1 温度对βD49G与NHaseK的影响72-75
• 4.4.1.2 pH对βD49G与NHaseK的影响75-76
• 4.4.1.3 βD49G与NHaseK的动力学参数76-77
• 4.4.2 βD49G与NHaseK的全细胞催化工艺对比77-81
• 4.4.2.1 全细胞转化温度的确定77-78
• 4.4.2.2 全细胞转化pH的确定78-79
• 4.4.2.3 助溶剂甲醇浓度的确定79-80
• 4.4.2.4 细胞量的确定80-81
• 4.5 本章小结81-83
• 第五章 结论与展望83-85
• 5.1 结论83-84
• 5.2 展望84-85
• 参考文献85-92
• 附录92
• 附录Ⅰ 主要实验仪器设备92-93
• 附录Ⅱ 主要实验试剂93-94
• 附录Ⅲ 腈水合酶NHaseK基因序列94-95
• 附录Ⅳ 质粒图谱95-98
• 作者简介98

【参考文献】

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本文编号：558994