基于衍生化技术的磷脂高效分析新方法及其应用研究

发布时间：2017-07-20 22:04

  本文关键词：基于衍生化技术的磷脂高效分析新方法及其应用研究

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【摘要】：磷脂是生物体内种类最多的一类脂质,磷脂代谢与许多不同疾病如心血管疾病等密切相关,是重要的信号分子。通过了解磷脂化合物在生物体内的代谢状况,结合磷脂特有的生理功能,进而可全面深入地研究磷脂在生命活动过程中的作用,对脂质组学及脂质营养的研究具有重要的意义。但是PLs种类极为繁多,结构复杂,因此对生物体内复杂磷脂类化合物的分析是一项非常有挑战性的工作。本课题以磷脂类化合物为研究对象,将体外化学衍生化技术与电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)技术相结合,开展基于化学衍生化技术的磷脂高选择性、高灵敏定性和定量分析新方法研究,以解决现有质谱技术在磷脂分析检测中存在的技术瓶颈。本论文研究结果如下:1.建立了基于丙酮稳定同位素标记技术相对定量分析磷脂酰乙醇胺(PE)的方法。通过丙酮稳定同位素标记技术(ASID),结合DNLS-shotgun ESI-MS/MS技术使PE的分析灵敏度提高了2.2-2.5倍。通过d0-丙酮和d6-丙酮衍生化后产生的6Da质量差实现了单个PE分子种类的相对定量分析,为解决磷脂分析中定量难的瓶颈问题提供了新思路。应用所建方法,完成了对20%猪油高脂,20%橄榄油高脂喂养和正常饲料喂养大鼠肝脏中PE分子的定性和相对定量分析,并通过多变量分析成功的找出了差异显著的PE分子种类。分析结果对高脂膳食引发的慢性疾病相关脂质类生物标志物的发掘具有指导意义。2.丙酮虽然常见易得,但它只能针对PE、PS等含有氨基的磷脂种类进行衍生化反应。因此,本章又建立了一种基于甲基化和同位素标记技术的磷脂高效定性定量分析方法。一方面通过“轻”,“重”标记后的目标分析物按等比例混合实现了PLs的相对定量分析;另一方面,通过以“轻”标记的磷脂标准品作为内标,实现了PLs的绝对定量分析。此外,三甲基硅烷化重氮甲烷对磷脂甲基化后,PC、PE、PS、PA、PG和PI六类磷脂的检测灵敏度分别提高了1.18-,10.21-,10.21-,14.03-,104.13-及7.28倍。通过基于混合模式固相萃取技术可快速分离血浆磷脂,结合所建立的基于甲基化和稳定同位素标记技术的磷脂高效高通量分析方法,对高血脂病人血浆中磷脂组分含量的变化进行分析。共鉴定出血浆中的33种PC,25种PE,22种PG,15种PS,17种PI和18种PA,且找出了30种具有显著差异的磷脂分子种类。并进一步验证了基于甲基化和同位素标记技术的磷脂相对定量和绝对定量分析方法的可行性和实用性。所建立的磷脂分析方法简单实用,拓宽了内标物的选择范围,对脂质组学和脂质化学与营养的研究都具有重要意义。3.建立了结构磷脂的shotgun-MS分析方法。应用该方法结合单因素实验和响应面实验研究了酶法合成富含花生四烯酸结构磷脂的工艺。得出最佳的工艺条件为:反应温度55.6℃,反应时间25.1 h,酶添加量15.3%,底物摩尔比1:10.1。在此最优条件下,ARA结合率可达15.42%,富含ARA结构磷脂的产率为13.26%。并对合成产物中的卵磷脂(PC)分子种类进行了鉴定。该研究为富含n-6系列PUFA结构磷脂的营养学特性研究及相关功能脂质产品研发奠定了基础。
【关键词】：磷脂 衍生化 质谱 定性定量分析 结构磷脂
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.63;TQ645.96
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文缩略表11-12
• 第一章 引言12-25
• 1.1 磷脂概述12-14
• 1.2 磷脂的分离方法14-18
• 1.2.1 薄层色谱法14
• 1.2.2 固相萃取法14-15
• 1.2.3 高效液相色谱法15-18
• 1.3 磷脂的质谱检测技术18-20
• 1.3.1 直接进样质谱技术18-19
• 1.3.2 HPLC-MS19-20
• 1.4 磷脂的定量分析方法20-21
• 1.4.1 化学衍生化技术概述20
• 1.4.2 磷脂的定量分析方法20-21
• 1.5 磷脂分析方法在脂质组学中的应用21-22
• 1.6 课题研究的目的和意义22-23
• 1.7 课题研究的内容23-25
• 第二章 丙酮稳定同位素标记相对定量分析磷脂酰乙醇胺25-38
• 2.1 实验仪器与试剂26
• 2.1.1 实验仪器26
• 2.1.2 实验材料与试剂26
• 2.2 实验方法26-28
• 2.2.1 丙酮稳定同位素衍生PE26-27
• 2.2.2 质谱分析方法27
• 2.2.3 定性和相对定量方法27
• 2.2.4 肝脏样品中PE分析27-28
• 2.3 结果与讨论28-37
• 2.3.1 衍生化反应条件优化28-30
• 2.3.2 质谱分析灵敏度的提高30-31
• 2.3.3 相对定量方法的建立和验证31-32
• 2.3.4 大鼠肝脏组织中PE分析32-37
• 2.4 本章小结37-38
• 第三章 基于甲基化和同位素标记技术的磷脂高效定量分析方法建立及应用38-58
• 3.1 仪器与试剂39-40
• 3.1.1 实验仪器39
• 3.1.2 实验试剂39-40
• 3.2 实验方法40-43
• 3.2.1 三甲基硅烷化重氮甲烷衍生PLs40
• 3.2.2 质谱条件40-41
• 3.2.3 基于甲基化和同位素标记技术的磷脂相对定量分析方法建立41-42
• 3.2.4 基于甲基化和同位素标记技术的磷脂绝对定量分析方法建立42
• 3.2.5 血浆样本中磷脂分析42-43
• 3.3 结果与讨论43-57
• 3.3.1 衍生反应前后质谱行为考察及质谱条件优化43-44
• 3.3.2 衍生反应条件优化44-45
• 3.3.3 检测灵敏度的提高45-46
• 3.3.4 相对定量分析方法的建立46-47
• 3.3.5 绝对定量分析方法的建立47-49
• 3.3.6 血浆样本中磷脂分析49-57
• 3.4 本章小结57-58
• 第四章 磷脂分析方法在酶法合成富含花生四烯酸结构磷脂研究中的应用58-68
• 4.1 仪器与试剂58-59
• 4.1.1 实验仪器58-59
• 4.1.2 实验试剂59
• 4.2 实验方法59-61
• 4.2.1 花生四烯酸乙酯（ARA-EE）合成与纯化59-60
• 4.2.2 酶法合成富含ARA的结构磷脂60
• 4.2.3 磷脂中脂肪酸分析60
• 4.2.4 结合率和产率测定60
• 4.2.5 ARA结构磷脂shogun-MS鉴定60-61
• 4.2.6 数据分析61
• 4.3 结果与讨论61-67
• 4.3.1 ARA-EE合成与纯化61
• 4.3.2 酶法合成ARA型磷脂的工艺条件优化61-65
• 4.3.3 合成ARA结构磷脂产物分析65-67
• 4.4 本章小结67-68
• 第五章 全文结论68-70
• 参考文献70-78
• 致谢78-79
• 作者简历79
• 硕士在读期间发表的科研论文79

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