分子改造提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性

发布时间：2017-07-26 18:34

  本文关键词：分子改造提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性

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【摘要】：谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase),是一种能催化蛋白质交联的酰胺转移酶。由于催化活性不依赖于Ca2+,来源于链霉菌的TGase广泛应用于食品、纺织、皮革及生物医药领域。但较低的TGase的热稳定性,使链霉菌TGase作为优良的催化剂在工业中的应用受到严重的限制。本研究以来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13的TGase为研究对象,应用定点突变、短肽融合及两者组合的策略提高TGase的热稳定性,主要研究结果如下:(1)定点突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性通过PoPMusic-2.1预测了降低TGase分子折叠能的氨基酸位点P132和分子结构模拟选中来源于吸水链霉菌的TGase基因中的W388号位点,并构建了相应的突变体。酶学分析表明,突变体P132I在50℃水浴下的半衰期达到5 min,较野生TGase提高31%;P132号位点其他的突变体较野生酶提高2-13.7%。对W388号位点的饱和突变则未能得到热稳定性提高的突变体。此外,P132I和P132G比酶活亦分别较野生酶提高24%和12.4%,其它突变体比酶活变化不明显。作用力分析发现,突变体P132I中较野生TGase增加两个氢键。上述结果表明,基于蛋白质折叠自由能分析的定点突变能有效提高TGase的热稳定和催化活性,氢键的增加可能是P132I热稳定性提高的原因之一。(2)融合双亲短肽提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性将来源于Saccharomy cescerevisiae Zuotion蛋白的双亲短肽SAP1融合至TGase前导肽C端、成熟酶N端及C端,分别得到TGase融合酶QC-SAP1、N-SAP1和C-SAP1;将N端loop作为linker连接成熟酶的C端与双亲短肽SAP1得到融合C-L-SAP1。与野生酶相比,突变体N-SAP1在50℃下的半衰期提高78.9%,其它三个突变体则提高5-24%;各突变体比酶活下降4-30.3%。结构分析显示,N-SAP1蛋白颗粒较野生酶显著增大,且各突变体与野生酶的二级结构基本一致。上述结果表明,末端融合双亲短肽SAP1能有效的提高TGase的热稳定性,酶蛋白聚合有可能是突变体热稳定性提高的重要原因。(3)复合突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性为进一步提高TGase的热稳定性,将N-SAP1中的P132分别突变为异亮氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺,构建得到TGase复合突变体N-P132I、N-P132G、P132M以及P132Q。酶学分析表明,突变体N-P132I较野生TGase相比在50℃下的半衰期提高105%,其他的突变体较野生TGase提高68.4-100%。复合突变后,4个突变体的比酶活相比野生TGase下降6.5-14.5%,其中突变体N-P132I的比酶活下降了14.5%。上述结果说明,结合两种改造策略能有效提高TGase的热稳定性,同时保证较高的催化活性。
【关键词】：谷氨酰胺转胺酶 热稳定性 折叠自由能 定点突变 双亲短肽
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.8
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 绪论7-12
• 1.1 谷氨酰胺转胺酶概述7-8
• 1.1.1 谷氨酰胺转胺酶的催化特性、来源及活化机制7-8
• 1.1.2 谷氨酰胺转胺酶的应用8
• 1.2 分子改造提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性8-9
• 1.2.1 链霉菌谷氨酰胺转胺酶的结构与功能8-9
• 1.2.2 谷氨酰胺转胺酶热稳定性改造进展9
• 1.3 酶分子热稳定性改造策略9-11
• 1.3.1 定点突变提高酶分子的热稳定性10
• 1.3.2 融合双亲短肽提高酶分子热稳定性10-11
• 1.3.3 酶分子热稳定性改造的其他策略11
• 1.4 研究意义11
• 1.5 研究内容11-12
• 第二章 材料与方法12-19
• 2.1 材料12-13
• 2.1.1 菌株与质粒12
• 2.1.2 主要试剂12
• 2.1.3 主要仪器12
• 2.1.4 培养基12-13
• 2.1.5 主要溶液13
• 2.2 方法13-19
• 2.2.1 分子生物学操作13-15
• 2.2.2 TGase突变体的构建15-16
• 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法16
• 2.2.4 培养方法16
• 2.2.5 TGase的纯化方法16-17
• 2.2.6 分析方法17-19
• 第三章 结果与讨论19-33
• 3.1 定点突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性19-23
• 3.1.1 突变位点的确定19
• 3.1.2 突变体的表达19-20
• 3.1.3 饱和突变体热稳定性初筛20-21
• 3.1.4 突变体的纯化及酶学性质测定21-22
• 3.1.5 突变体热稳定性提高机制解析22-23
• 3.2 融合双亲短肽提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性23-29
• 3.2.1 不同的位置融合双亲短肽的质粒构建23-24
• 3.2.2 突变体的表达与纯化24-25
• 3.2.3 突变体酶学性质分析25-26
• 3.2.4 突变体的二级结构分析26-27
• 3.2.5 突变体N-SAP1扫描电镜分析27
• 3.2.6 C端柔性增强对TGase酶热稳定性的影响27-29
• 3.3 复合突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性29-33
• 3.3.1 复合突变位点确定29
• 3.3.2 复合突变体的表达及纯化29-30
• 3.3.3 复合突变体酶学性质分析30-31
• 3.3.4 复合突变体热稳定性提高机制分析31-33
• 主要结论与展望33-35
• 主要结论33
• 展望33-35
• 致谢35-37
• 参考文献37-41
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文41

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本文编号：577804