绿豆肽的结构鉴定及对小鼠巨噬细胞免疫活性物质的影响作用研究

发布时间：2017-07-27 09:36

  本文关键词：绿豆肽的结构鉴定及对小鼠巨噬细胞免疫活性物质的影响作用研究

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【摘要】：蛋白质水解形成的具有生物活性的肽类被证实是涉及人体内多种细胞功能的重要物质,生物活性肽的各种功能活性及作用机理的研究是开发蛋白肽保健功能食品和药品的重要理论基础。本文以Alcalase 2.4L碱性蛋白酶水解得到的绿豆肽(MBPs)为研究对象,通过氨基酸自动分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、傅里叶变换红外光谱、高效液相色谱和质谱等方法,分析其氨基酸组成、分子量分布和结构特点,进而研究其对巨噬细胞内糖原、核酸、酸性ATP酶(ATPase)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响,并通过测定巨噬细胞NO的分泌量、iNOS活性以及iNOSmRNA表达量等指标讨论其对巨噬细胞免疫活性的影响。研究内容和结果如下:1.MBPs的结构鉴定和分析。水解度为32.25%的MBPs共包含17种氨基酸,包括非极性氨基酸28.37%、极性中性氨基酸15.03%、酸性氨基酸32.27%和碱性氨基酸24.33%,免疫相关的非极性和碱性氨基酸含量较高;SDS-PAGE和HPLC显示其分子量在6.5KDa以下的含量丰富。红外结果显示,MBPs可能含多种不饱和基团,仍含有蛋白质二级结构中的α-螺旋和β-折叠,而不规则卷曲和β-转角结构已被酶解而打开;质谱得到MBPs包含216种肽段主要归属于匹配度较高的24种蛋白质来源,肽末端非极性和碱性氨基酸含量较高。2.MBPs对巨噬细胞中活性物质的影响。MBPs对巨噬细胞增殖的MTT法检测结果显示,MBPs能够显著促进巨噬细胞的增殖(P0.05),并能减弱LPS对巨噬细胞增殖的抑制作用;MBPs培养的巨噬细胞糖原和核酸染色明显加深,一定程度上反应了MBPs培养后巨噬细胞活跃度增强;MBPs浓度为200μg/mL以上时对巨噬细胞内ATPase活性有显著的促进作用(P0.05),MBPs可以显著缓解LPS对ATPase活性的抑制;MBPs浓度大于100μg/mL时,对巨噬细胞内LZM活性增强作用显著(P0.05),对LPS导致的LZM活性减弱有显著(P0.05)的缓解作用。MBPs浓度在200μg/mL以上才对巨噬细胞酶内SOD活性和抑制LPS的刺激作用有显著的效果(P0.05)。3.MBPs对巨噬细胞NO、iNOS及iNOS mRNA的影响。MBPs对巨噬细胞的培养时间在24h之后显著(P0.05)增强其NO分泌量。MBPs对巨噬细胞NO分泌有促进作用,添加量为10μg/mL时对巨噬细胞NO分泌量影响不显著(P0.05),浓度为200μg/mL和400μg/mL两组之间比较没有统计学上的差异,MBPs对巨噬细胞分泌NO的促进效果较LPS低,并可以显著降低LPS对巨噬细胞的刺激。MBPs和LPS都能够显著(P0.05)提高iNOS的活性,但MBPs又能够抑制LPS导致的iNOS过度表达,且MBPs浓度越高作用效果越明显。iNOSmRNA实时荧光定量PCR分析结果显示,MBPs培养的巨噬细胞中iNOSmRNA表达量有所增加,但低于LPS单独刺激的作用效果,MBPs也可以减轻LPS引起的巨噬细胞iNOSmRNA的过度表达。MBPs分子量大多集中在6.5KDa以下,结构存在α-螺旋和不规则卷曲,包含肽段丰富。MBPs能够促进巨噬细胞的增殖提高巨噬细胞活性,对巨噬细胞NO分泌、i NOS活性和iNOSmRNA表达的也有促进作用,说明能促使巨噬细胞发挥免疫作用。
【关键词】：绿豆肽 结构分析 巨噬细胞 一氧化氮 免疫调节
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O629.72;TS201.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-21
• 1.1 食源性免疫活性肽的研究现状11-13
• 1.1.1 动物源免疫活性肽11-12
• 1.1.2 植物源免疫活性肽12-13
• 1.1.3 免疫活性肽的研究前景13
• 1.2 免疫活性肽的调节机理研究进展13-14
• 1.3 免疫活性肽对巨噬细胞的调节作用14-16
• 1.4 绿豆蛋白源生物活性肽的研究进展16-18
• 1.4.1 ACE抑制活性16-17
• 1.4.2 抗氧化活性17
• 1.4.3 免疫活性17-18
• 1.5 课题的研究背景及意义18-19
• 1.6 课题研究的主要内容19-20
• 1.7 技术路线20-21
• 第二章 MBPs的结构鉴定和分析21-33
• 2.1 试验材料与设备21-22
• 2.1.1 试验材料21
• 2.1.2 试验仪器与设备21-22
• 2.2 试验方法22-24
• 2.2.1 MBPs的制备工艺22
• 2.2.2 绿豆蛋白氨基酸组成分析22
• 2.2.3 电泳测定MBPs相对分子量分布22-23
• 2.2.4 高效液相测定MBPs相对分子量分布23
• 2.2.5 傅里叶变换红外光谱测定MBPs结构23
• 2.2.6 质谱测定MBPs结构23-24
• 2.3 结果与分析24-30
• 2.3.1 MBPs氨基酸组成分析24-25
• 2.3.2 MBPs相对分子量分布的测定25-26
• 2.3.3 MBPs结构的傅里叶红外光谱测定26-28
• 2.3.4 MBPs结构的质谱测定28-30
• 2.4 讨论30
• 2.5 小结30-33
• 第三章 MBPs对巨噬细胞中活性物质的影响33-47
• 3.1 试验材料与设备33-34
• 3.1.1 试验材料33-34
• 3.1.2 试验仪器与设备34
• 3.2 试验方法34-38
• 3.2.1 试验路线34
• 3.2.2 巨噬细胞复苏、传代与冻存34-35
• 3.2.3 试验分组与处理35
• 3.2.4 蛋白质抽提与定量35-36
• 3.2.5 MTT检测巨噬细胞增殖36
• 3.2.6 巨噬细胞活性成分的测定36-37
• 3.2.7 溶菌酶LZM测定37
• 3.2.8 超氧化物歧化酶SOD活力测定37-38
• 3.2.9 统计分析38
• 3.3 结果与分析38-45
• 3.3.1 MTT法检测巨噬细胞增殖38-39
• 3.3.2 MBPs对巨噬细胞糖原和核酸的影响39-42
• 3.3.3 MBPs对巨噬细胞中ATPase的影响42-43
• 3.3.4 MBPs对巨噬细胞LZM和SOD活力的影响43-45
• 3.4 讨论45
• 3.5 小结45-47
• 第四章 MBPs对巨噬细胞NO、iNOS及iNOS mRNA的影响47-59
• 4.1 试验材料与设备47-48
• 4.1.1 试验材料47
• 4.1.2 试验仪器与设备47-48
• 4.2 试验方法48-51
• 4.2.1 巨噬细胞复苏、传代与冻存48
• 4.2.2 试验分组与处理48
• 4.2.3 蛋白质抽提与定量48
• 4.2.4 对NO分泌的影响检测48-49
• 4.2.5 iNOS活性的测定49-50
• 4.2.6 iNOSmRNA表达的测定50-51
• 4.3 结果与分析51-56
• 4.3.1 MBPs对NO分泌的影响51-53
• 4.3.2 MBPs对i NOS活性的影响53-54
• 4.3.3 MBPs对i NOSmRNA表达的影响54-56
• 4.4 讨论56
• 4.5 小结56-59
• 第五章 结论59-61
• 5.1 结论59-60
• 5.2 主要创新点60
• 5.3 问题与展望60-61
• 参考文献61-67
• 致谢67-68
• 个人简历68
• 个人情况68
• 教育背景68
• 科研经历68
• 在学期间发表论文68

【参考文献】

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本文编号：580822